Гармин 4: Ваш браузер устарел – Москва

Эхолот Garmin STRIKER Plus 4 — Москва

Эхолот Garmin STRIKER Plus 4 совмещает в себе функции эхолота и картплоттера благодаря встроенной GPS антенне. Обладает ярким цветным дисплеем диагональю 11 см и разрешением 480×272 пикселей. Интуитивно понятный интерфейс пользователя позволяет легко найти нужные функции. С помощью данного эхолота можно находить интересные места для рыбалки, сохранять их координаты, а на следующей рыбалке без труда выйти на эту же точку. Встроенное картографическое программное обеспечение Garmin Quickdraw Contours в автоматическом режиме создает карты глубин с изобатами через 30 см для площади до 8000 квадратных километров. Поставляется в комплекте с двухчастотным CHIRP датчиком 77/200 кГц.

Эхолот Garmin STRIKER Plus 4 отображает рельеф и структуру дна, текущую глубину и температуру воды, создает собственные карты глубин, находит рыбу и показывает глубину до нее. STRIKER Plus 4 – это отличный выбор современного недорогого эхолота с GPS навигатором для поиска рыбы и успешной рыбалки с лодки на судака, щуку и любую другую рыбу.

Основные функции:

• Яркий цветной QSVGA дисплей с диагональю 11 см (4.3″) и разрешением 480 x 272 пикселей. Регулируемая LED подсветка.





• Сохранение координат интересных мест с помощью встроенного высокочувствительного 1 Гц GPS приемника, который очень точно определяет местоположение лодки на воде и не теряет сигнал.





• Встроенное картографическое программное обеспечение Quickdraw Contours позволяет автоматически создавать и сохранять карты с изобатами через 0.3 метра для площади до 8000 квадратных километров.





• Комплектуется двухлучевым трансдьюсером CHIRP 77/200 кГц, который обеспечивает более высокий уровень четкости и детализации изображения рыбы и подводных объектов.





• Определение скорости лодки относительно берега по GPS сигналу.





• Обладает прочной конструкцией для любого типа рыбалки.

Технические характеристики:

Тип дисплея	QSVGA, цветной
Диагональ дисплея	4. 3″ (11 см)
Разрешение дисплея	480 x 272 пикселей
Размеры	98 х 174 х 45 мм
Трансдьюсер	CHIRP 77/200 кГц
Максимальная рабочая глубина	В пресной воде: 480 метров. В соленой воде: 225 метров.
Подсветка	LED
Водонепроницаемость	IPx7
Мощность	200 Вт RMS
Рабочее напряжение	12 В постоянного тока (10-17 В)
Язык меню	Русский (+ другие языки)
Официальная гарантия	24 месяца

Функциональные особенности:

A-scope (индикация рыбы, в реальном времени)	Да
AutoGain (фильтр шумов)	Да
График температуры воды	Да
Подвижная линия глубины	Да
Отображение рыбы в виде иконки	Да
Определение расстояния до рыбы	Да
Масштабирование	Да
Garmin Quickdraw Contours	Да

Комплектация:

• Эхолот Garmin STRIKER Plus 4





• Крепление дисплея





• Трансдьюсер CHIPR 77/200 кГц





• Кабель питания





• Заводское крепление датчика на транец лодки





• Инструкция на русском языке





• Официальный гарантийный талон Garmin

Здесь Вы можете скачать руководство пользователя на русском языке для эхолота Garmin Striker Plus 4:
Скачать инструкцию на русском языке для эхолота Garmin Striker Plus 4

GPS-эхолот Garmin Striker Plus 4

GPS-эхолот Striker Plus 4 – это простой в использовании эхолот с 4-дюймовым экраном, встроенной GPS-антенной и двухлучевым эхолотом с CHIRP. В отличие от предшественника обладает функцией построения карт “на лету” Quick Draw Contours. Гарантия 24 месяца.

 

1. GPS-эхолот Garmin Striker Plus 4.

2. Двухлучевой датчик 77/200кГц.

3. Крепеж датчика к транцу и троллинговому электромотору.

4. Кабель питания и передачи данных.

5. Подставка под GPS-эхолот с тремя винтами.

6. Документация.

• Русифицирован.
• Гарантия 24 месяца.
• Поставляется с двухлучевым датчиком (77/200 кГц) с технологией CHIRP, позволяющей получать более четкое изображение и лучше разделять цели в толще воды.
• Позволяет находить рыбу, обозначать точками места поклевок, интересные места, причалы, слипы, и возвращаться на них.
• Оснащен встроенной функцией QuickDraw Contours, позволяющая создавать карты глубин в реальном времени.
• Имеет увеличенный по сравнению с предшественником размер экрана (диагональ 4,3″).
• Интуитивно понятный инферфейс.
• Встроенный флешер.
• Герметичный корпус.

 

Quickdraw Contours

Функция QuickDraw Contours позволяет создавать карту глубин прямо во время рыбалки. Просто перемещайтесь по водоему, например ловите на дорожку, а Striker Plus 4 сам отрисует все изобаты. Специальных знаний или опыта не требуется. Память прибора позволяет сохранять до 8000 кв.км. карт глубин. Однако имейте ввиду, что в отличие от старших моделей с диагональю экрана 7 и 9 дюймов, Striker Plus 4 не может обмениваться данными с другими устройствами по WiFi.

 

 

GPS-эхолот Striker Plus 4 позволит Вам легко найти рыбу. Вы можете пометить рыбу, донные структуры, слипы, причалы, места хорошего клева, и вернуться на них. Если у Вас есть друзья-владельцы эхолотов  Striker или Echomap, то Вы можете легко обменяться с ними путевыми точками. С помощью технологии Smooth Scaling™ graphics переключение между диапазонами глубин происходит плавно. Вы можете прокрутить обратно эхограмму и поставить маршрутную точку на интересующем Вас объекте. В дополнение, в Striker Plus 4 есть встроенный флешер, а скорость движения выводится на экран. В комплект поставки входит крепление эхолота с регулируемыми углами наклона и поворота, двухлучевой датчик CHIRP (77/200кГц) с крепежом на транец и на троллинговый мотор. 

 

GPS-эхолот Striker Plus 4 использует технологию CHIRP для повышения четкости изображения и лучшего разделения целей.  Эхолоты с CHIRP излучают сигнал не на одной частоте, а в некотором диапазоне частот, в этом случае возвратившееся эхо содержит больше информации для обработки. Форма объектов на дне определяется лучше, близко находящиеся рыбы на экране разделяются четче.

 

Функция GPS-приемника

Благодаря встроенной высокочувствительной  GPS-антенне Striker Plus 4 определяет ваше положение на воде. GPS позволяет вам ставить путевые точки,  отмечая ими места с интересным рельефом, точки поклевок, слипы, причалы, опасные места. К любой точке можно возвращаться позже, или наоборот, ее избегать. Кроме того, вы можете легко создавать маршруты и двигаться по ним.

Кроме этого, функция GPS позволяет вывести на экран скорость движения, что актуально, например, при ловле на дорожку, или при передвижении по акваториям с ограничением скорости (например, по Новоладожскому каналу). 

С путевыми точками на экране Вы не заблудитесь

На странице карты вы можете видеть свое положение по отношению к другим точкам. Используйте эту страницу, чтобы легко находить путевые точки, ставить их и двигаться к ним. Также с помощью страницы карты легко и просто возвращаться на берег.

 

 

 

 

Хотите купить GPS-эхолотStriker Plus 4 по лучшей цене? Жмите на кнопку “В корзину” и оформляйте заказ.

Картплоттер Garmin Striker plus 4 cv

Рыбопоисковый эхолот с дисплеем 4,3”, GPS, передовым сонаром и программой Quickdraw Contours для создания карт

• Включает трансдьюсер для встроенного традиционного сонара Garmin CHIRP и сканирующего сонара CHIRP ClearVü
• Встроенное картографическое программное обеспечение Garmin Quickdraw™ Contours позволяет создавать и сохранять карты с изобатами через 30 см для площади до 8000 кв. км
• Встроенный 1 Гц GPS-приемник для отметки маршрутных точек, создания маршрутов и просмотра скорости судна
• Яркий дисплей 4.3” с отличным качеством изображения даже при солнечном свете и интуитивный интерфейс пользователя
• Прочная конструкция для любого типа рыбалки

Рыбопоисковый эхолот STRIKER Plus 4cv с ярким дисплеем 4,3” и встроенным GPS-приемником включает традиционный сонар Garmin CHIRP, сканирующий сонар Garmin CHIRP ClearVü и программу Quickdraw Contours для создания и хранения карт с изобатами через 30 см для площади до 8 тыс. кв.км. Встроенный GPS-приемник служит для отметки маршрутных точек, создания маршрутов и просмотра скорости судна.

Программа Garmin Quickdraw Contours

Никто не знает водоем лучше, чем тот, кто в нем рыбачит. Пока вы плаваете вдоль берегов и на глубине, программа Quickdraw Contours создает рыболовные карты HD для тех мест, в которых вы побывали. От пользователей не требуются специальные знания. Устройство STRIKER Plus 4cv позволяет сохранить до 2 миллионов акров карт Quickdraw Contours с изобатами через 30 см.

Четкие изображения сканирующего сонара CHIRP ClearVü

Рыбопоисковый эхолот STRIKER Plus 4cv включает технологию Garmin CHIRP, которая в сочетании со сканирующим сонаром Garmin ClearVü обеспечивает почти фотографические изображения того, что находится под судном. Вы получите четкую картину подводного рельефа, объектов и рыбы. Традиционный сонар Garmin CHIRP обеспечивает отличное разделение целей. Таким образом, данный трансдьюсер поможет вам поймать больше рыбы.

Рыбопоисковый эхолот с GPS

Встроенный высокочувствительный GPS-приемник определяет и поддерживает ваше местоположение в любой точке на воде. Устройство позволяет отмечать разные места с помощью маршрутных точек. Таким образом, найдя удачное место с хорошим клевом, вы можете отметить эту точку и вернуться туда в следующий раз. Кроме того, можно отмечать доки, слипы и прочие места на озере, чтобы создавать маршруты для следующих поездок.

Благодаря GPS-приемнику устройство STRIKER Plus 4cv может отображать на экране скорость судна, чтобы вы могли корректировать скорость траления в соответствии с используемой блесной.

Устройство, разработанное специально для вас

Модель STRIKER Plus 4cv, предназначенная для использования в любой среде, сделает рыбалку еще более приятной. Яркий дисплей обеспечивает четкое изображение того, что находится под вашим судном, даже в солнечные дни. Большие размеры экрана позволяют вам лучше рассмотреть подводный мир. Благодаря интуитивному интерфейсу пользователя вы сможете без труда выбирать нужные функции.

Обзор на эхолот Garmin Striker plus 4

Характеристики

Основными характеристиками эхолота Striker plus 4 являются:

• стационарное расположение корпуса;
• наличие трансдьюсера;
• трансдьюсер крепится на транец;
• цветной экран;
• диагональ экрана 4,3 дюйма;
• зарисовка карт с использованием функции QuickDraw Contours;
• внутренняя память для применения QuickDraw Contours;
• два луча – 15 и 30°;
• выходная мощность с комплектным датчиком равняется 500 Вт.

После первого включения эхолота требуется выбрать нужные параметры: настроить часовой пояс, язык и параметры лодки. Только после этих действий возможно переместиться в основное меню устройства и лично ознакомиться со всеми его функциями.

В пресной воде глубина сканирования достигает 480 м, что немаловажно.

Высокое качество изображения также служит основной характеристикой эхолота.

Возможности

• создание карт и их последующее сохранение;
• получение изображения;
• разделение целей;
• возможность создания маршрутов;
• контроль скорости судна.

Получение четкого изображения обуславливается наличием двухлучевого трансдьюсера с классическим сонаром Garmin CHIRP. С помощью данного сонара есть прекрасная возможность четко разделять цели.

У эхолота отсутствует боковое излучение.

Прибор отображает скорость судна на дисплее, что позволит вам скорректировать скорость тралирования в зависимости от используемой блесны.

Интуитивный интерфейс пользователя позволяет без напряжения подобрать нужные вам функции.

Основные преимущества

Преимуществами эхолота считаются наличие влагонепроницаемого дисплея, встроенный датчик температуры и GPS-модуль. Яркий дисплей позволяет передавать отличное качество изображения даже при ярком солнечном свете, а встроенный GPS-модуль позволяет отмечать маршрутные точки, создавать карты и сохранять их с изобатами через 30 см для расстояния в восемь тысяч км квадратных. Также преимуществом является плотная конструкция прибора, позволяющая заниматься любым видом рыбалки.

Программа Quickdraw Contours будет создавать карты тех мест, которые были посещены рыбаками, вне зависимости от того, происходило плавание на поверхности воды или в толще.

Минимализация шума при работе эхолота позволит не отвлекаться на посторонние звуки и сосредоточиться на ловле рыбы. Цель появляется на экране с соответствующим символом, обозначенным также рыбой.

Высокая чувствительность встроенного GPS-приемника позволяет определять и поддерживать ваше местоположение в любой точке на воде. Также, вы сможете отмечать разные рыбные места при помощи маршрутных точек и вернуться туда позднее. Эта функция хорошо поможет при прокладывании маршрута для следующей рыбалки, ведь у вас есть возможность отметить на карте слипы, доки и прочие места на озерах.

Комплектация

• эхолот;
• двухлучевой трансдьюсер;
• кабель питания;
• поворотная скоба;
• крепеж.

Однако, вам может понадобится чехол для эхолота, дополнительные крепежи и прочее.

Эхолот Striker plus 4 сделает рыбалку более комфортной. Устройство предназначено для рыбной ловли в любой среде. Яркое изображение на дисплее передаст четкое изображение того, что находится под вашим судном. Большое разрешение экрана позволит рассмотреть толщу воды и дно водоема. Необходимые функции вы легко отыщите при помощи интуитивного интерфейса.

Одна из самых экономичных моделей, которая, несмотря на доступную стоимость, обладает хорошим функционалом. Устройство удобно в управлении, меню простое и понятное. Подробная информация дается в инструкции, идущей в комплекте. Компактные размеры позволяют легко транспортировать устройство.

Автор: Виталий Деринговский,
копирайтер, рыболов

стаж любительской рыбалки 2 года

Эхолот Garmin Striker Plus 4

Рыбопоисковый эхолот с дисплеем 4,3”, GPS, передовым сонаром и программой Quickdraw Contours для создания карт

• Включает двухлучевой трансдьюсер с традиционным сонаром Garmin CHIRP
  для получения четких изображений и отличного разделения целей




• Встроенное картографическое программное обеспечение Garmin
  Quickdraw™ Contours позволяет создавать и сохранять карты с изобатами
  через 30 см для площади до 8000 кв. км




• Встроенный 1 Гц GPS-приемник для отметки маршрутных точек, создания маршрутов и просмотра скорости судна




• Яркий дисплей 4.3” с отличным качеством изображения даже при солнечном свете и интуитивный интерфейс пользователя




• Прочная конструкция для любого типа рыбалки

Рыбопоисковый эхолот STRIKER Plus 4 с ярким дисплеем 4.3” и
встроенным GPS-приемником включает сонар CHIRP для получения четких
изображений и программу Quickdraw Contours
для создания и хранения карт с изобатами через 30 см для площади до
8000 кв км. Встроенный GPS-приемник служит для отметки маршрутных точек,
создания маршрутов и просмотра скорости судна.

Программа Garmin Quickdraw Contours

Никто не знает водоем лучше, чем тот, кто в нем рыбачит. Пока вы
плаваете вдоль берегов и на глубине, программа Quickdraw Contours
создает рыболовные карты HD для тех мест, в которых вы побывали. От
пользователей не требуются специальные знания. Устройство STRIKER Plus 4
позволяет сохранить до 2 миллионов акров карт Quickdraw Contours с
изобатами через 30 см.

Четкость сонара CHIRP

Рыбопоисковый эхолот STRIKER Plus 4 включает технологию Garmin CHIRP
для обеспечения высокого уровня четкости и детализации, которого вы
могли ожидать от такого производителя, как Garmin. Четкие изображения
сонара предлагают удивительное разделение целей и высокий уровень
разрешения и на мелководье, и на большой глубине. Контуры дна четко
видны даже на высоких скоростях судна. На глубине можно включить функцию
подавления шума для возможности своевременной интерпретации изображения
того, что находится под судном.

Рыбопоисковый эхолот с GPS

Встроенный высокочувствительный GPS-приемник определяет и
поддерживает ваше местоположение в любой точке на воде. Устройство
позволяет отмечать разные места с помощью маршрутных точек. Таким
образом, найдя удачное место с хорошим клевом, вы можете отметить эту
точку и вернуться туда в следующий раз. Кроме того, можно отмечать доки,
слипы и прочие места на озере, чтобы создавать маршруты для следующих
поездок.

Благодаря GPS-приемнику устройство STRIKER Plus 4 может отображать на
экране скорость судна, чтобы вы могли корректировать скорость траления в
соответствии с используемой блесной.

Устройство, разработанное специально для вас

Модель STRIKER Plus 4, предназначенная для использования в любой
среде, сделает рыбалку еще более приятной. Яркий дисплей обеспечивает
четкое изображение того, что находится под вашим судном, даже в
солнечные дни. Большие размеры экрана позволяют вам лучше рассмотреть
подводный мир. Благодаря интуитивному интерфейсу пользователя вы сможете
без труда выбирать нужные функции.

GPS/эхолот трекплоттер Garmin Striker 4 plus

О товаре

 Garmin Striker 4 plus – не только универсальный, а также простой в эксплуатации прибор. Он оснащен всем тем, что Вы хотите иметь в своем приборе. Давайте разберемся, в чем же его плюсы.

– Четкость. С помощью трансдьюсера Garmin CHIRP (77/200 кГц) картинка становится четкой и реалистичной.

– Фантазируйте. Создавайте для себя карту «рыболовных мест». Благодаря эхолоту Garmin Striker 4 plus и функции Quickdraw Contours показывайте точками «места побед».

– Контроль скорости. Узнать с какой скоростью Вы передвигаетесь очень просто-посмотрите на экран своего прибора! 

– Ваш помощник GPS. Чтобы не потерять “места клева”, просто необходимо поставить точку на вашей карте, и вернуться туда снова!

Комплектация Garmin Striker
1).	Рыбопоисковый эхолот STRIKER Plus 4
2).	Двухлучевой трансдьюсер Garmin
3).	Кабель питания/ данных
4).	Наклонная/ поворотная скоба
5).	Крепеж
6).	Документация
Основные характеристики
Язык меню	Русский
Тип	GPS эхолот
Расположение корпуса	стационарное
Влагозащищенный корпус	Есть
Степень влагозащиты	IPX7
Трансдьюсер
Тип	Традиционный: 50/77/83/200 кГц
Количество лучей	4
Отображение структуры дна	Нет
CHIRP	Да
Нижнее сканирование (Downscan)	Нет
Боковое сканировние (Sidescan)	Нет
Крепление трансдьюсера	универсальное
3D-режим	Нет
Макс. глубина сканирования в пресной воде
Мощность, Вт (RMS)	Мах. 200
Экран
Сенсорный экран	Нет
Тип экрана	QSVGA цветной
Диагональ экрана	4,3″
Разрешение экрана	272 X 480
Дополнительная информация
AutoGain минимум шума, максимум полезных сигналов	Да
Возможность подключения двулучевого излучателя	Да
Возможность подключения двухчастотного излучателя	Да
График температуры воды	Да
Напряжение питания, В	12v (10-17vDC)
Функциональность
Построение карт глубин	Да, в приборе
Определение размера/глубины рыбы	Да
Датчик температуры	Встроеный
Запись траектории	Да
Увеличение изображения	Да
Габариты и вес
Вес	300г
Ширина	98мм
Высота	174мм
Глубина	45мм

Garmin Vivofit 4 черный большого размера

Функция Garmin Move IQ™ автоматически обнаруживает занятия и классифицирует их тип в приложении Garmin Connect. Найдите новые способы, чтобы улучшить свои вчерашние результаты, вместе с vívofit® 4. Этот простой в использовании трекер активности позволяет вам двигаться без остановок для подзарядки (период работы батареи более 1 года). Модель vívofit 4 идеально подходит для круглосуточного ношения, чтобы вы могли в любой момент отслеживать данные ваших занятий, автоматически классифицировать их с помощью Move IQ и использовать другие функции.

Ношение 24 часа в сутки

Трекер активности vívofit 4 отслеживает ваши данные 24 часа в сутки. Благодаря периоду работы батареи более 1 года вы можете не брать с собой шнур для зарядки. Устройство не боится воды, и его не нужно снимать в бассейне и душе. Постоянно включенный цветной дисплей обеспечивает яркое и четкое изображение даже при солнечном свете. Чтобы браслет отражал вашу индивидуальность, вы можете выбирать различные цветовые темы экрана, циферблаты и текстовые фразы. Кроме того, предлагаются сменные ремешки различного цвета и стиля.

Дополнительные инструменты под рукой

Модель vívofit 4 включает несколько новых инструментов, которые помогут сделать вашу жизнь комфортнее. Виджет погоды быстро и наглядно покажет вам, что ожидать от сегодняшнего дня⁴. С помощью приложения можно настроить будильник, который сработает на устройстве. Кроме того, можно настроить вычитающий таймер, чтобы вы не забыли вовремя выключить духовку. Не можете найти телефон? vívofit 4 поможет вам отыскать его.

Автоматическая запись занятий

Вам не придется запускать и останавливать таймер занятия вручную – эту задачу берет на себя Move IQ. Эта функция автоматически обнаруживает и классифицирует различные типы занятий – ходьба, бег, велоспорт, плавание и тренировки на эллиптическом тренажере. Для ходьбы и бега устройство даже автоматически запускает таймер занятия. Позже вы можете просмотреть записанные данные в приложении Garmin Connect™.

Персонализированное слежение за активностью плюс мотивация

Устройство vívofit 4 побуждает вас подняться и начать двигаться. В дополнение к отслеживанию шагов, расстояния, сожженных калорий и параметров сна, оно измеряет периоды неактивности. Когда вы слишком долго остаетесь на одном месте, на экране появляется цветная полоса. Чтобы сбросить этот индикатор, нужно встать и походить в течение пары минут. Кроме того vívofit 4 изучает ваш уровень активности и предлагает целевое количество шагов на день. В зависимости от того, как вы справитесь с этой задачей, прибор скорректирует задание на следующий день, мотивируя вас вести более здоровый образ жизни.

Обмен данными и соревнования

В течение дня vívofit 4 периодически синхронизируется с приложением Garmin Connect². С помощью Garmin Connect™ вы сможете улучшить свои вчерашние результаты еще легче, чем раньше. Приложение обеспечивает яркое и наглядное представление ваших данных. Прокрутив экран, вы можете легко сравнить сегодняшние показатели с прошлыми достижениями. Нажав на нужное поле, вы получите детальную информацию о занятиях и спортивных показателях. Приложение позволяет настроить формат отображения данных, чтобы вы могли видеть только интересующую вас информацию.

Соревнуйтесь с детьми по количеству шагов

Функция Toe-to-Toe™ позволяет соревноваться с детьми по количеству шагов. Ваш трекер активности vívofit 4 может установить беспроводную связь с находящимся рядом детским прибором vívofit jr. 2 или другим устройством vívofit 4 для запуска хронометрируемого соревнования по количеству шагов. Эта функция управляется с помощью браслета, и после завершения соревнования оба участника увидят на экране общее количество шагов за учитываемое время, чтобы определить победителя.

¹ При типовом режиме эксплуатации; период работы батареи может меняться в зависимости от использования

² Точность трекера активности

³ Водостойкость

⁴ Требуется соединение с Garmin Connect Mobile

Harmine, ингибитор киназы, регулируемой фосфорилированием тирозина (DYRK) с двойной специфичностью, индуцирует каспазо-опосредованный апоптоз в нейробластоме | Cancer Cell International

Chemicals

Harmine (рис. 1), LDN-192960 и INDY были приобретены у Cayman Chemical. Твердые вещества соединения хранили при -20 ° C. Исходные растворы получали растворением гармина (100 мМ), LDN-192960 (40 мМ) и INDY (40 мМ) в стерильном ДМСО (VWR). Исходные концентрации фильтровали перед добавлением к культурам клеток.

Рис. 1

Химическая структура гармина. Гармин – это бета-карболиновый алкалоид, присутствующий в растении Peganum harmala и некоторых других средиземноморских растениях. Гармин обладает рядом фармацевтических характеристик, включая необратимое ингибирование моноаминоксидазы А (МАО-А), и демонстрирует цитотоксичность в отношении различных линий раковых клеток. Молекулярная масса гармина составляет 212,25 г / моль

.

Культура клеток

Клеточные линии NB человека KELLY (также известные как N206; #

411 от Sigma), SK-N-AS (называемые SKNAS в этом исследовании; CRL-213 от ATCC), SK-N-BE (клон SKNBE (2) C, названный SKNBE в этом исследовании; CRL-2268 от ATCC), и SK-N-FI (названный SKNFI в этом исследовании; от Группы детской онкологии) культивировали в RPMI 1640 (VWR) с добавлением 10% термоинактивированная фетальная бычья сыворотка (Invitrogen), пенициллин (100 МЕ / мл) и стрептомицин (100 мкг / мл) (30-002-CI, Corning). Все элементы были приобретены у соответствующих поставщиков в течение последних 2 лет. Клетки поддерживали при 37 ° C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ .

Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток и IC ₅₀ определяли с использованием анализа жизнеспособности клеток RealTime-Glo MT (G9712, Promega). Этот реагент позволяет непрерывно измерять жизнеспособность клеток в одной лунке. Клетки высевали с плотностью 4000 клеток / лунку на непрозрачные аналитические планшеты с белыми стенками.После 24 часов для прикрепления посеянным клеткам их обрабатывали концентрацией гармина в диапазоне от 0 до 1 мМ. Субстрат жизнеспособности клеток MT и фермент NanoLuc уравновешивали до 37 ° C, готовили 2 × реагента RealTime-Glo и в каждую лунку добавляли равный объем. Для измерения нулевого времени клетки инкубировали с реагентом в течение 20 минут при 37 ° C, и люминесценцию измеряли на считывающем устройстве для микропланшетов Biotek Synergy. Люминесценцию измеряли через 24, 48 и 72 ч после добавления гармина.

Анализ цитотоксичности

Колориметрический анализ SRB использовали для измерения цитотоксичности, как описано ранее, после лечения ингибитором DYRK2 LDN-192960 или ингибитором DYRK1A / B INDY [15,16,17]. Вкратце, клетки NB помещали в прозрачные плоские 96-луночные планшеты и оставляли для прикрепления в течение ночи. В начале каждого эксперимента (t = 0) и после обработки лекарствами клетки фиксировали 10% TCA при 4 ° C в течение 1 ч, промывали деионизированной водой и сушили при комнатной температуре.Затем клетки окрашивали 100 мкл 0,4% SRB в 1% уксусной кислоте в течение 20 минут при комнатной температуре, пять раз промывали 1% уксусной кислотой и давали высохнуть при комнатной температуре. В каждую лунку добавляли 100 мкл 10 мМ трис-HCl pH 7,0, встряхивали в течение 10 мин при комнатной температуре и считывали при 540 нм с использованием ридера для микропланшетов Molecular Devices Flexstation 3.

Анализы активности каспаз

Количественную оценку относительной активности каспаз в клетках, обработанных гармином, проводили с использованием наборов для анализа Caspase-Glo 3/7 и Caspase-Glo 9 (G8091 и G8211, соответственно, от Promega). Клеточные линии высевали при плотности 16000 клеток / лунку в непрозрачные 96-луночные планшеты с белыми стенками. Через 24 часа после посева клетки обрабатывали 0, 25, 50 и 100 мкМ гармина в течение 24 часов. Реагенты Caspase Glo добавляли к клеткам и инкубировали при комнатной температуре. Люминесценцию измеряли с помощью ридера для микропланшетов Biotek Synergy каждые 20 мин в течение 3 ч.

Вестерн-блоттинг

Лизаты целых клеток получали с использованием буфера для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA), (20 мМ Трис-HCl [pH 7.5], 135 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 0,1% (мас. / Об.) Лаурилсульфата натрия, 10% (об. / Об.) Глицерина, 0,5% (мас. / Об.) Дезоксихолата натрия и 1% (об. / Об.) Тритона. Х-100). В буфер RIPA добавляли коктейль ингибиторов протеазы cOmplete ™ (Roche) и 0,27 мМ Na ₃ VO ₄ и 20 мМ NaF в качестве ингибиторов фосфатазы. Концентрацию белка определяли с помощью анализа белка с красителем Брэдфорд (Bio-Rad). Равные количества белка разделяли с использованием 12% SDS-PAGE и переносили на 0,45 мкМ поливинилидендифторидную мембрану Immobilon-P (Millipore). Перенесенные белки инкубировали со следующими первичными антителами: кроличьи поликлональные антитела PARP (# 9542) от Cell Signaling Technologies в разведении 1: 1000 и мышиные моноклональные антитела GAPDH (# SC-47724) от Santa Cruz Biotechnology в разведении 1: 1000. После инкубации блотов с первичным антителом при 4 ° C в течение не менее 8 часов их промывали и инкубировали со вторичными антителами при разведении 1:10 000 в течение 1 часа при комнатной температуре. В качестве вторичных антител использовали LiCor IRDye ^® 680RD Goat anti-Mouse IgG (925-68070) и LiCor IRDye ^® 680RD Goat anti-Rabbit IgG (925-68710).

Обнаружение аннексина V

Для количественной оценки процента (%) индукции апоптоза в NB-клетках, обработанных гармином, использовали набор для обнаружения аннексина V APC (88-8007, Invitrogen). Образцы были приготовлены в соответствии с протоколом производителя и проанализированы методом проточной цитометрии. Вкратце, клетки высевали на ночь, а затем обрабатывали 0 мкМ или 100 мкМ гармина в течение 24 ч при 37 ° C. Клетки собирали центрифугированием и окрашивали окрашивающим раствором аннексина V APC / DAPI при комнатной температуре в течение 20 минут в темноте.Затем клетки собирали центрифугированием, суспендированными в PBS (pH 7,4), и немедленно анализировали с помощью проточной цитометрии. Возбуждение / испускание для аннексина APC и DAPI составляло 633/700 и 350/450 нм соответственно.

Молекулярный докинг DYRK2 и гармина

Модель молекулярного докинга для DYRK2 в комплексе с гармином была построена путем идентификации целевых структур из банка данных белков (PDB) [18]. Кристаллическая структура человеческого DYRK1A (PDB ID: 3ANR) в комплексе с гармином была опубликована ранее [13, 18].Чтобы предсказать, образует ли DYRK2 также комплекс с гармином, мы сгенерировали модель молекулярной стыковки с координатами из существующей кристаллической структуры DYRK2 в комплексе с лейцеттином (PDB: 4AZF), используя онлайн-стыковочный веб-сервер SwissDock (http: //www.swissdock .ch /) [18,19,20,21]. Цепь A 4AZF была выделена из исходной кристаллической структуры, и лиганд лейцеттина L41 был удален. Затем модифицированная структура была введена в SwissDock вместе с химической структурой гармина (ZINC ID: 27646846), взятой из базы данных молекул ZINC (http: // zinc.docking.org/) [19, 20]. Конформационная ΔG была рассчитана и признана наиболее подходящей по параметрам, установленным SwissDock. Полученная модель молекулярного взаимодействия была визуализирована с помощью визуальной молекулярной динамики (VMD) [22].

Выравнивание последовательностей NCBI BLAST

Выравнивание последовательностей семейства DYRK проводили с помощью инструмента Blastp, предоставленного Национальным центром биотехнологической информации (NCBI) [23, 24]. Аминокислотные последовательности DYRK1A человека и DYRK2 человека, используемые для выравнивания, были взяты из базы данных инструмента поиска базового локального выравнивания (BLAST) (номер доступаQ13627 и AAH06375 соответственно) (https://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) [18, 24]. Обложка запроса, представленная здесь, была дана как часть выходных данных программы Blastp, как и процент идентичности и соответствующее E-значение.

Анализ общедоступного набора данных экспрессии мРНК NB

Для анализа экспрессии гена DYRK у пациентов с человеческими NB, крупнейшей общегеномной когорты NB, для которой было выполнено полногеномное секвенирование РНК опухоли, SEQC-498, (n = 498; GSE62564) был проанализирован с использованием платформы анализа и визуализации геномики R2, разработанной в Департаменте онкогеномики Академического медицинского центра Амстердамского университета (http: // r2.amc.nl). Данные экспрессии для наборов данных были получены из общедоступного набора данных Gene Expression Omnibus (GEO) на веб-сайте NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) и проанализированы, как описано ранее [25].

Статистический анализ

Статистическая значимость измерений жизнеспособности клеток (рис. 2b) была рассчитана с использованием пакета GraphPad Prism 7 (https://www. graphpad.com/) и непарного t-критерия Стьюдента, предполагающего нулевую гипотезу. был выполнен. Изменение активности каспазы количественно оценивали путем вычисления среднего кратного изменения после нормализации экспериментальных образцов к их соответствующим контролям.Значимость как активации каспазы, так и измерений апоптоза аннексина V (рис. 3, 4) рассчитывалась с использованием непарного t-критерия Стьюдента, предполагая нулевую гипотезу. Корреляцию экспрессии мРНК опухоли NB гена DYRK с вероятностью выживания (рис. 7) оценивали с помощью анализа Каплана-Мейера с использованием лог-рангового теста, как описано [26]. Чтобы определить оптимальное значение экспрессии гена, которое можно установить в качестве порогового значения, все образцы опухолей сначала были отсортированы в соответствии с экспрессией мРНК гена, а затем разделены на две группы.Анализы выполняли в группах, разделенных средними или средними значениями экспрессии мРНК опухоли. Корреляция экспрессии мРНК DYRK с опухолью Амплификация гена MYCN определялась с использованием непараметрического рангового критерия Краскала-Уоллиса. Для всех тестов значение P <0,05 считалось статистически значимым.

Рис. 2

Гармин индуцирует гибель NB-клеток. a клеточных линий NB (SKNBE, KELLY, SKNAS и SKNFI) обрабатывали 100 мкМ гармина или оставляли без обработки в течение 24–72 часов.Репрезентативные микрофотографии показывают влияние 100 мкМ гармина на морфологию клеток через 72 часа (см. Дополнительный файл 1: рис. S1 для микрофотографий, характерных для обработки гармином через 24 и 48 часов). b IC ₅₀ кривых, представляющих измерения жизнеспособности клеток с использованием Glo (Promega) в реальном времени. Клеточные линии NB постоянно подвергались воздействию гармина в различных концентрациях (0–1 мМ) в течение 72 часов с измерениями через 24, 48 и 72 часа. Значения были нормализованы к контролю и представляют собой среднее значение трех независимых экспериментов ± S.Д. (n = 3)

Рис. 3

Гармин активирует каспазу-3/7 и каспазу-9 в клетках NB. Клеточные линии NB (SKNBE, KELLY, SKNAS и SKNFI) обрабатывали гармином (0, 50, 100 мкМ) в течение 24 часов и измеряли активность каспаз. a Caspase-3/7 и b caspase-9 значительно активируются в присутствии гармина (100 мкМ). Результаты были получены с использованием аналитических систем Caspase-Glo, как указано в разделе «Методы». Результаты были нормализованы к контрольному значению каждой клеточной линии; показано изменение кратности для каждой клеточной линии.Данные представляют собой среднее значение трех независимых экспериментов, каждый из которых выполнен в двух экземплярах ± стандартное отклонение. (n = 6). Изменение активации рассчитывалось с использованием непарного t-критерия Стьюдента, предполагая нулевую гипотезу. Звездочкой отмечены статистически значимые изменения активности каспаз по сравнению с контролем (P <0,05)

Рис. 4

Гармин индуцирует расщепление PARP в клетках NB. Клеточные линии NB (SKNBE, KELLY, SKNAS и SKNFI) подвергали воздействию увеличивающихся концентраций гармина (0–100 мкМ) в течение 24 часов и исследовали на предмет расщепления PARP, индикатора прогрессирующего апоптоза. Лизаты целых клеток собирали с использованием буфера для лизиса RIPA и анализировали на расщепление PARP с помощью вестерн-блоттинга. Данные представляют три независимых эксперимента (n = 3)

Комбинация гармина и эксендина-4 значительно увеличивает массу бета-клеток человека in vivo: количественная оценка и визуализация с помощью iDISCO + 3D-визуализации

Аннотация

Поскольку любой диабет является результатом уменьшения количества функциональных бета-клеток поджелудочной железы, необходимы препараты для регенерации бета-клеток. оптимальное и масштабируемое лечение диабета в будущем.Хотя в клинической практике используются многие лекарства от диабета, ни одно из них не увеличивает количество бета-клеток человека. Мы показали, что комбинация ингибитора DYRK1A, гармина, с агонистом рецептора GLP1, эксендином-4, заметно увеличивает пролиферацию бета-клеток человека in vitro . Однако технологические ограничения не позволили оценить массу бета-клеток человека in vivo . Здесь мы описываем новый метод, который сочетает очистку тканей iDISCO ⁺ , иммуномечение инсулина, световую микроскопию и объемное количественное определение бета-клеток человека, трансплантированных иммунодефицитным мышам.Мы демонстрируем поразительное семикратное увеличение массы бета-клеток человека на in vivo на в ответ на трехмесячную инфузию комбинации гармин-эксендин-4, сопровождающееся снижением уровня глюкозы в крови, повышением концентрации человеческого инсулина в плазме и усилением пролиферации бета-клеток. Эти исследования впервые недвусмысленно демонстрируют, что фармакологическая экспансия бета-клеток человека представляет собой реалистичный и достижимый путь к терапии диабета и предоставляет строгий, совершенно новый и воспроизводимый инструмент для количественной оценки массы бета-клеток человека in vivo.

Введение

Все формы диабета в конечном итоге являются результатом недостаточного количества нормально функционирующих бета-клеток поджелудочной железы. Отсюда следует, что регенерация достаточного количества полностью функционирующих бета-клеток человека может обратить вспять диабет. К сожалению, человеческие бета-клетки размножаются только в течение короткого периода в раннем детстве и устойчивы к регенерации во взрослом возрасте. Недавнее открытие препаратов для регенерации бета-клеток человека из класса ингибиторов DYRK1A, используемых отдельно – и особенно в комбинации с другими лекарствами, такими как агонисты рецепторов глюкагоноподобного пептида (GLP1) (GLP1RA), уже широко применяемые у людей с диабетом – обеспечило надеются, что терапевтическая регенерация бета-клеток человека достижима у взрослых (1–7).На сегодняшний день в этих исследованиях использовались суррогатные маркеры пролиферации бета-клеток человека, примером которых являются Ki67, BrdU, EdU и совместное иммуномечение фосфогистона-h4 с инсулин-положительными клетками, чтобы предположить, что может быть достигнута подлинная пролиферация бета-клеток. К сожалению, поскольку человеческие бета-клетки не могут выжить в культуре ткани более недели, остается недоказанным, могут ли эти потенциальные методы лечения привести к фактическому увеличению массы бета-клеток человека в долгосрочной перспективе.

Здесь мы описываем надежный метод точной количественной оценки долгосрочных изменений массы бета-клеток человека in vivo в ответ на потенциальные препараты для регенерации бета-клеток человека.Мы использовали трупные островки взрослого человека, трансплантированные в капсулу почек иммунодефицитных мышей NOD-SCID-gamma (NSG) (1–3), с последующим длительным лечением ингибитором DYRK1A (гармин) отдельно или в комбинации с широко используемым пептидом GLP1RA. (эксендин-4) в течение одного-трех месяцев. Мы объединили эту стандартную модель животного с усовершенствованной очисткой тканей iDISCO ⁺ , световой микроскопией и методами рендеринга трехмерных изображений для количественной оценки массы бета-клеток человека (7,8). Мы обнаружили, что совместное введение гармина и эксендина-4 увеличивает массу бета-клеток человека в 7 раз в течение трех месяцев без значительных изменений в массе альфа-клеток.Эти наблюдения вместе с предыдущими сообщениями о том, что комбинация гармина и эксендина-4 усиливает дифференцировку и функцию бета-клеток человека in vitro и in vivo (1–3), обеспечивают новый привлекательный путь к лечению диабета, а также строгий, совершенно новый и воспроизводимый метод количественной оценки массы бета-клеток человека и ответа на потенциальные будущие методы лечения in vivo .

Результаты

Процедуры, используемые для измерения массы бета-клеток человека, изображены на Рис.1 (1–3,7,8). Методы и подробные протоколы представлены в дополнительном материале . Во-первых, трупные островки человека, полученные от доноров человеческих органов, получают от Интегрированной программы распределения островков (IIDP) Национального института диабета и болезней почек (NIDDK) или у других дистрибьюторов. Во-вторых, островки трансплантируются в почечное субкапсулярное пространство мышей с иммунодефицитом NSG, как показано. В-третьих, мышей лечат носителем или представляющими интерес лекарствами (в данном случае агонистом рецептора GLP1, эксендином-4, гармином или комбинацией гармина и эксендина-4).Лечение проводится путем непрерывной инфузии с использованием осмотических мининасосов. В-четвертых, животных анестезируют и перфузируют 4% параформальдегидом (PFA) до in vivo фиксации интересующих антигенов. В-пятых, почки, несущие островки, удаляются, обрабатываются, метятся антисывороткой к инсулину или глюкагону и очищаются с использованием модификации метода iDISCO ⁺ (7,8). В-шестых, целые почки визуализируются с помощью световой микроскопии. В-седьмых, создаются трехмерные изображения, и объемы представляющих интерес типов клеток количественно оцениваются с использованием компьютерного анализа изображений.В-восьмых, трехмерные видеоизображения визуализируются для визуализации результатов.

Рисунок 1. Схематическое изображение рабочего процесса.

Изолированных островков взрослого человека получают от авторизованных поставщиков и трансплантируют в почечное субкапсулярное пространство. Это может быть выполнено на одной или обеих почках, в зависимости от дизайна эксперимента. После трансплантации островков, в зависимости от плана эксперимента, в межлопаточное пространство подкожно имплантируют осмотические мини-насосы, загруженные интересующими лекарствами, в данном случае разбавленными водой гармином и эксендин-4.Насосы работают в течение 28 дней, после чего эксперимент может быть завершен или может быть вставлен новый насос для замены. В заранее выбранный момент времени животных in vivo фиксируют 4% параформальдегидом (PFA), собирают интактные почки, иммуномечивают и осветляют с помощью iDISCO +. Осветленные почки исследуются с помощью световой микроскопии, Z-стеки преобразуются в трехмерные изображения, а объемы бета-клеток рассчитываются с использованием коммерческого программного обеспечения.

Количественная проверка анализа объема бета-клеток человека проиллюстрирована в Рис.2 . Рис. 2A – это видео (см. Приложение 1), иллюстрирующее визуализацию бета-клеточной массы в почечном субкапсулярном пространстве. Бета-клетки иммуномечены зеленым цветом, а «домашний» белок, актин гладких мышц, показан красным, чтобы выделить почку целиком и проиллюстрировать размещение трансплантата островков человека под капсулой почки. Рис. 2B предоставляет репрезентативные изображения (см. Дополнительные видеоролики 2-100, 2-300, 2-500 и 2-1000) трансплантатов островков человека, трансплантированных в возрастающих дозах от 100 до 1000 эквивалентов островков человека (IEQ, один IEQ = Островок диаметром 125 мкм) от трех разных доноров органов на три группы мышей. Мышам перфузировали PFA, сразу же (5 мин) после трансплантации извлекали почки для количественного определения массы бета-клеток, создавали трехмерные видеоролики и рассчитывали объем бета-клеток. Рис. 2C показывает теоретический объем трансплантированных островков человека (при условии, что один островок человека представляет собой сферу диаметром 125 мкм) и сравнивает его с фактическим измеренным объемом бета-клеток сразу после трансплантации островка (64 ± 11% объема островка. ). Рис. 2C также показывает, что масса бета-клеток быстро снизилась через две недели после трансплантации (49 ± 7% от исходной массы бета-клеток), что, вероятно, отражает быструю или немедленную гибель клеток в островках человека, трансплантированных в субкапсулу почек. лишены кровоснабжения в течение первых нескольких дней после трансплантации (9,10).Эти «стандартные кривые» и изменения в двухнедельный период времени обеспечивают уверенность в том, что масса бета-клеток, измеренная с использованием этих методов и постепенно увеличивающегося числа островков, является точной.

Рис. 2. Количественная оценка и проверка массы бета-клеток человека.

A. Пример трехмерного видео, показывающего трансплантат бета-клеток человека с использованием иммуномечения инсулина. Актин гладких мышц используется для визуализации всей почки. B. Четыре видеоизображения трансплантатов, собранных сразу после трансплантации 100, 300, 500 и 1000 эквивалентов островков взрослого человека (IEQ).Представитель четырех разных экспериментов. C. Сравнение теоретического объема бета-клеток в четырех группах в B, предполагая, что островки человека представляют собой сферы диаметром 125 мкм, с фактическими объемными измерениями бета-клеток в нулевой момент времени и через две недели после трансплантации. В нулевой момент времени измеренная масса бета-клеток составляет примерно 64% ​​от теоретического объема островка. Как и ожидалось, через две недели объем бета-клеток примерно на 49% ниже, что отражает смерть бета-клеток в ближайшем перитрансплантационном периоде (9,10).

Чтобы изучить возможные изменения массы бета-клеток человека в ответ на лечение носителем (физиологический раствор), эксендином-4, гармином или комбинацией гармина и эксендина-4, мы использовали осмотические мини-насосы, которые доставляют их активное содержимое путем непрерывной инфузии в течение одного месяца. . Для исследований, продолжавшихся три месяца, мы заменили оригинальные мини-насосы на новые мини-насосы, содержащие свежие лекарственные препараты, через 1 и 2 месяца. На рис. 3A-B представлены репрезентативные изображения трансплантатов островков человека, полученных от животных, получавших носитель или гармин плюс эксендин-4 для три месяца (см. Прил.Видео 3A и 3B). Это ясно дает понять, что в группе, получавшей лекарственное средство, произошло резкое увеличение массы бета-клеток человека. Действительно, Фиг. 3C демонстрирует, что трехмесячная обработка семи различных наборов островков человека и животных комбинацией гармин-эксендин-4 привела к значительному прогрессивному 7-кратному увеличению объема бета-клеток человека. Примечательно, что один гармин, по-видимому, увеличивал объем бета-клеток человека в 2-3 раза через три месяца по сравнению с группами носителя или эксендина-4, хотя это не достигло статистической значимости.Сам по себе эксендин-4 не имел никакого эффекта.

Рисунок 3. Количественное влияние гармина и эксендина-4 на массу и функцию бета-клеток человека.

А, Б. Примеры видеозаписей трансплантатов островков человека, собранных через три месяца (84 дня) после обработки носителем (вода) или гармином плюс эксендин-4 (H + E) и иммуномеченных на инсулин. C. Масса бета-клеток в трансплантатах островков человека в семи-восьми наборах островков человека у животных, получавших носитель (V), эксендин-4 (E), гармин (H) или гармин плюс эксендин-4 (H + E) в течение трех месяцев. D. Совместное иммуномечение инсулина и Ki67 в четырех группах панели B. E. Уровень глюкозы в крови в четырех группах панели B. F. Плазменный человеческий инсулин в четырех группах панели B. G. Изменения массы тела в четырех группах в B. * означает p <0,05 по сравнению с V; и ** указывает р <0,05 по сравнению с V и E, как по одностороннему дисперсионному анализу, так и по апостериорным тестам Тьюки или Холма.

Рис. 3D подтверждает предыдущие сообщения (1–3) о том, что гармин и гармин плюс эксендин-4 увеличивают совместную иммунную метку Ki67 с инсулином в трансплантатах островков человека in vivo . Рис. 3E-F показывают, что уровень глюкозы в крови снизился во всех трех группах лечения, а концентрации циркулирующего человеческого инсулина увеличились в группе гармина плюс эксендин-4. Фиг. 3G демонстрирует, что не было значительной разницы в увеличении массы тела между четырьмя группами после трех месяцев лечения носителем или активным лекарственным средством.

Доп. Фиг.1 показывает результаты, наблюдаемые в четырех дополнительных группах мышей, получавших носитель (физиологический раствор), эксендин-4, гармин или комбинацию гармина и эксендина-4 в течение одного месяца. Доп. Фиг. 1A демонстрирует, что комбинация гармина и эксендина-4 способна удвоить фактический объем бета-клеток человека всего за четыре недели. Доп. Фиг. 1B подтверждает, что гармин и гармин плюс эксендин-4 увеличивают совместную иммунную метку Ki67 с инсулином в трансплантатах островков человека in vivo после одного месяца лечения. Доп. Фиг.1C-D показывают, что уровень глюкозы в крови значительно снизился, а концентрации циркулирующего человеческого инсулина увеличились, хотя и незначительно, в группе гармина плюс эксендин-4.Как и у мышей, получавших лечение в течение трех месяцев, не наблюдалось значительных различий в приросте массы тела между четырьмя группами после одного месяца лечения ( Suppl. Fig. 1E ).

Общие результаты по массе бета-клеток человека in vivo проиллюстрированы на Рис. 4 . Черная линия, полученная из рис. 2 и 3 суммирует объем бета-клеток человека на исходном уровне, один месяц и три месяца в островках человека, трансплантированных и обработанных носителем. Как сообщалось ранее (9,10), масса бета-клеток резко снижается после трансплантации и после этого остается неизменной. Действительно, хотя мы не оценивали объем бета-клеток в первую неделю после трансплантации, первоначальное снижение объема бета-клеток, вероятно, происходит в течение первого или двух дней после трансплантации (9,10), как показано зеленой пунктирной линией. Сама по себе обработка эксендином-4 не оказывает никакого эффекта, тогда как только гармин поддерживает массу бета-клеток на уровне, близком к исходному. Примечательно, что в группе гармина плюс эксендин-4 объем бета-клеток человека аналогичен исходному уровню через месяц после трансплантации (предположительно, восстановившись после первоначального снижения, как показано пунктирной зеленой линией).К трем месяцам объем бета-клеток в 3 раза превышает массу изначально пересаженных бета-клеток. По сравнению с надиром массы бета-клеток в контрольной группе через три месяца это представляет 7-кратное увеличение, как показано вертикальной зеленой стрелкой.

Рисунок 4. Схема влияния комбинации гармин-эксендин-4 на массу бета-клеток человека

A. Данные взяты из фиг. 2 и 3. Масса бета-клеток человека у мышей NSG, получавших носитель (черная линия), снижается после трансплантации и остается стабильной в течение следующих двух месяцев.Один эксендин-4 (серая линия) не влияет на объем бета-клеток, тогда как один гармин (синяя линия) приводит к значительно большему объему бета-клеток, чем носитель или эксендин-4. У мышей, получавших гармин-эксендин-4 (красная линия), объем бета-клеток остается стабильным в течение первого месяца и заметно увеличивается к концу месяца 3. Поскольку масса бета-клеток заметно снижается в первый день или дни после трансплантации (8 , 9), реальный ход событий, скорее всего, напоминает зеленую пунктирную линию. B. Семикратное увеличение объема бета-клеток, показанное зеленой стрелкой, отражает разницу между группами, получавшими носитель, и комбинированными группами, получавшими гармин-эксендин-4, через три месяца. Серый прямоугольник указывает на потенциальные механизмы, которые могут указывать на увеличение массы бета-клеток человека. См. Текст для получения дополнительных сведений.

Гармин также увеличивает пролиферацию альфа-клеток in vitro (1–4,17). Чтобы проверить, сопровождалось ли увеличение массы бета-клеток человека увеличением массы альфа-клеток, мы проанализировали объем альфа-клеток в тех же образцах, которые описаны в рис. 3 и Suppl. Рис.1 . На фиг. 5A-B представлены репрезентативные трехмерные изображения трансплантатов островков человека, полученных от животных, получавших носитель или гармин плюс эксендин-4 в течение одного месяца и окрашенных как на инсулин, так и на глюкагон (см. Suppl.Видео 4A и 4B). Полные одно- и трехмесячные исследования не выявили разницы в массе человеческих альфа-клеток в четырех различных группах лечения ( Рис. 5C # x0026; E ). Пролиферация человеческих альфа-клеток не претерпевала значительных изменений в трансплантатах от мышей, получавших любое из активных лекарств, по сравнению с мышами, получавшими носитель, через один месяц ( фиг. 5D ). После трех месяцев лечения мыши, получавшие гармин плюс эксендин-4, показали умеренное, но значительное увеличение пролиферации человеческих альфа-клеток по сравнению с мышами, получавшими носитель ( рис.5F ).

Рисунок 5. Количественное влияние гармина и эксендина-4 на массу и пролиферацию альфа-клеток человека.

А, Б. Примеры видеозаписей трансплантатов островков человека, собранных через месяц после обработки носителем (вода) или гармином плюс эксендин-4 (H + E) и иммуномеченных на глюкагон. C. Масса альфа-клеток в трансплантатах островков человека в пяти-шести различных наборах островков человека и животных, получавших носитель (V), эксендин-4 (E), гармин (H) или гармин плюс эксендин-4 (H + E) на один месяц. D. Совместное иммуномечение глюкагоном и Ki67 в четырех группах на панели B. E. Масса альфа-клеток в трансплантатах островков человека в семи-восьми наборах островков человека у животных, получавших носитель (V), эксендин-4 (E ), гармин (H) или гармин плюс эксендин-4 (H + E) в течение трех месяцев. F. Совместное иммуномечение глюкагона и Ki67 в четырех группах на панели E. * показывает p <0,05 по сравнению с V с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA и апостериорных тестов Тьюки или Холма.

Обсуждение

В совокупности эти исследования обеспечивают два важных и новых достижения.Во-первых, они предоставляют первые воспроизводимые, строгие, количественные инструменты для оценки общей массы бета- и / или альфа-клеток человека в любой системе in vivo и для определения изменений с течением времени при лечении лекарственными препаратами. Этот набор инструментов удовлетворяет острую потребность в исследованиях диабета человека в целом и в исследованиях регенерации бета-клеток в частности. Мы ожидаем, что это станет новым эталоном для количественной оценки массы бета-клеток человека на животных моделях. Во-вторых, исследования предоставляют недвусмысленные доказательства того, что лечение комбинацией гармин-эксендин-4 (или, действительно, любым препаратом-агонистом GLP-1R) может привести к фактическому увеличению массы бета-клеток человека. Это важное наблюдение: хотя в настоящее время во всем мире клинически используется около 30 различных лекарств от диабета, ни одно из них не приводит к увеличению массы бета-клеток человека. Таким образом, эти исследования начинают заполнять критический терапевтический пробел при диабете: восстановление массы бета-клеток человека.

Настоящее исследование расширяет полезный профиль комбинации гармин-эксендин-4. Например, комбинация не только увеличивает массу бета-клеток человека, она также обращает вспять диабет в стандартной модели трансплантата островкового трансплантата человека с маргинальной массой in vivo NSG STZ-диабетической мыши с диабетом типа 1 (3), усиливает экспрессию в человеческих бета-клетках спектр маркеров дифференцировки бета-клеток человека, таких как PDX1, NKX6.1, MAFA, MAFB, SLC2A2, GLP1R среди других, и усиливает стимулированную глюкозой секрецию инсулина, как in vitro, , так и in vivo (1–3). Таким образом, комбинация гармин-эксендин-4 способна не только восстанавливать массу бета-клеток человека, но также и функцию бета-клеток in vitro, и in vivo, , что является двумя ключевыми целями исследований диабета 1 типа. Не менее важно, что комбинация гармин-эксендин-4 усиливает дифференцировку, пролиферацию и функцию бета-клеток в островках, полученных от доноров органов с диабетом 2 типа (3).

Хотя это важные шаги в исследованиях регенерации бета-клеток человека, они открывают ряд дополнительных возможностей для исследований, которые в этой области следует рассмотреть в течение следующих нескольких лет. Во-первых, хотя три месяца являются продолжительным эталоном для исследований трансплантации островков человека у мышей NSG, это не приближается к продолжительности жизни человека при диабете типа 1 и типа 2. Таким образом, потребуются более длительные исследования (например, 6-12 месяцев), чтобы определить, как долго масса бета-клеток человека будет продолжать увеличиваться, как долго будет сохраняться пролиферация бета-клеток и как долго сохраняется гликемический контроль.Также очень важно выяснить, прекратится ли пролиферация человеческих бета-клеток после прекращения лечения гармин-эксендином-4, и сохранится ли заметное увеличение массы бета-клеток после отмены препарата.

Это исследование поднимает интригующие механистические вопросы. Хотя 7-кратное увеличение массы бета-клеток человека за три месяца отрадно, маловероятно, что это увеличение является исключительным результатом пролиферации бета-клеток. Скорость пролиферации бета-клеток человека от гармина (1), гармина плюс ингибиторы TGFβ (2) и гармина плюс эксендин-4 (3) существенно выше in vitro , чем in vivo .Например, один гармин индуцирует индекс мечения Ki67 бета-клеток в островках человека in vitro 1,5-2,5% (1-5), выход гармина плюс ингибиторы TGFβ составляет 5-8% (2), а выход гармина плюс эксендин-4 дает аналогичный 5-8% индекс маркировки Ki67 in vitro (3). Соответствующие индексы мечения Ki67 в трансплантатах in vivo исследований составляют 0,7% для одного гармина, 1,5% для гармина плюс ингибиторы TGFβ и 1,5% для гармина плюс эксендин-4 (1–3). Мы предполагаем, что более низкие скорости пролиферации in vivo отражают местное производство антипролиферативных факторов роста в почечной капсульной среде, которые отсутствуют или уменьшены in vitro . Какой бы ни была причина, относительно скромная скорость пролиферации in vivo в текущих и предыдущих исследованиях кажется маловероятной, чтобы вызвать 7-кратное увеличение массы бета-клеток человека за три месяца. Конечно, возможно, что мы могли пропустить временные более высокие темпы пролиферации, временами, не оцениваемые здесь, например, 2, 6, 8 или 10 недель.

Мы считаем вероятным, что пролиферация является одним из важных факторов увеличения массы бета-клеток из комбинации гармин-эксендин-4.Мы также считаем, что этому эффекту способствуют дополнительные механизмы. Неоднократно было показано, что препараты семейства GLP1 увеличивают выживаемость бета-клеток (11). Повышенная выживаемость бета-клеток после трансплантации островков может быть вероятным фактором в первые дни после трансплантации, если предположить, что лекарства могут получить доступ к плохо васкуляризированным островкам в первые несколько дней после трансплантации. Также вероятно, что повышенная экспрессия факторов транскрипции бета-клеток, маркеров дифференцировки и стимулированная глюкозой секреция инсулина, упомянутые выше (1–3), могут повысить производительность трансплантата островков человека, а также количество инсулин-положительных клеток, обнаруженных при иммуномечении, что способствует к увеличению массы бета-клеток. Наконец, также возможно, что трансдифференцировка альфа-клеток или других эндокринных клеток в бета-клетки также может играть роль. Действительно, есть доказательства того, что это может происходить среди островковых клеток человека и может быть усилено обработкой агонистами рецептора GLP1 (12–14). В этом отношении увеличение пролиферации альфа-клеток в отсутствие увеличения массы альфа-клеток особенно интригует: возможно ли, что вновь реплицирующиеся альфа-клетки становятся бета-клетками?

Остается неизвестным, какая точная скорость и продолжительность регенерации бета-клеток потребуются для обращения вспять диабета 1 или 2 типа у людей.7-кратное увеличение массы бета-клеток человека за три месяца предполагает, что терапевтически значимое увеличение вполне достижимо. В самом деле, возникает вопрос, может ли эта скорость быть слишком агрессивной, и, возможно, ее необходимо уменьшить, изменив режим дозирования и введения.

Гармин и эксендин-4 были доставлены системно в этом исследовании, без попыток нацелить их конкретно на бета-клетки. Хотя здесь не наблюдалось изменений в массе альфа-клеток, а также они не наблюдались в печени, почках, селезенке, сердце или поджелудочной железе в нашем более раннем исследовании (3), мы не можем быть уверены, что расширение в других клетках или органах не произойдет в ответ на системное лечение гармином и эксендином-4.Некоторые могут предпочесть специфическую нацеленную на бета-клетки доставку лекарств, однако в настоящее время не существует идеальной целевой молекулы, специфичной для бета-клеток человека, и не является однозначно очевидным, что специфичное для бета-клеток нацеливание конъюгата гармин-эксендин-4 или другой молекулы является эффективным. требуется. Прояснение этих вопросов – основная цель NIDDK и других финансирующих диабет агентств по всему миру.

В целом, область диабета продвинулась от широко распространенного убеждения, что терапевтическая регенерация бета-клеток человека недостижима, до текущего состояния, в котором она кажется достижимой.Комбинация моделей трансплантации островков человека и методологии трехмерного измерения массы бета-клеток человека iDISCO ⁺ , применяемой к трансплантированным островкам человека, как описано в настоящем документе, обеспечивает важные инструменты для следующих этапов этого процесса.

Методы

Островки поджелудочной железы человека

Островки поджелудочной железы взрослого человека от 22 недиабетических доноров были предоставлены Integrated Islet Distribution Network и Prodo Laboratories. Средний возраст доноров составил 48 ± 3 года, 59% были донорами-мужчинами.Дополнительная информация представлена ​​в дополнительной таблице № 1 .

Chemicals

Гармин-HCl был синтезирован в Институте открытия лекарств на горе Синай (15,16). Эксендин-4 был приобретен в MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ).

Трансплантация островков человека мышам NSG

Островки человека трансплантировали в субкапсулярное пространство почек, как подробно описано ранее (1–3). Количество эквивалентов островков человека приведено в пояснениях к рисункам.Все протоколы были выполнены с одобрения и в соответствии с руководящими принципами, установленными Медицинской школой Икана при Институциональном комитете по уходу и использованию животных Mount Sinai.

Мини-насос для доставки гармина и эксендина-4

Растворенные в воде гармин и эксендин-4 загружали в мини-осмотические насосы Alzet (Купертино, Калифорния) модель 1004 в концентрации 27 мг / мл и 1 мг / мл соответственно. , чтобы обеспечить подкожную доставку гармина и эксендина-4 в течение одного месяца с постоянной скоростью 3 мг / кг / день и 0.1 мг / кг / сут соответственно. В трехмесячных исследованиях помпы были заменены через 28 дней и 56 дней на новые помпы и свежие гармин и эксендин-4.

Фиксация и сбор трансплантата почечных островков

Во время сбора трансплантата животных анестезировали ингаляционным изофлураном (3%) и in vivo, перфузировали 4% PFA. Собирали целые почки и помещали в 4% PFA на ночь.

Модифицированное иммуномечение тканей iDISCO + и очистка

Почки были обезвожены, отбелены пероксидазой, снова регидратированы и проницаемы перед иммуномечением антиинсулином (A5064, Agilent, Санта-Клара, Калифорния), антиглюкагоном (ab137817, Abcam, Cambridge, MA ) и актина против гладких мышц (A5228, Millipore-Sigma, St. Louis, MO) и вторичные антитела (A-21450 и A-32754, Thermo Scientific, Waltham, MA). После иммуномечения ткань была обезвожена, и очистка была достигнута с использованием модифицированного метода очистки iDISCO + (7,8), как подробно описано в Supplemental Material .

Light-Sheet Microscopy

Z-образные оптические срезы были получены с использованием UltraMicroscope II (LaVision BioTec GmbH, Германия), как описано в Supplemental Material .

Анализ вычислительных данных, визуализация изображений и количественная оценка массы бета-клеток

Целые почки были визуализированы в 1.3x с динамической фокусировкой и 4x с несколькими z-стеками с перекрытием 20% и мозаикой с использованием плагина TeraStitcher через программное обеспечение ImSpector Pro (LaVision Biotec, Билефельд, Германия). Цифровая визуализация и количественная оценка объемных и поверхностных изображений были созданы с использованием программного обеспечения Imaris (Bitplane, Белфаст, Соединенное Королевство) с использованием функции поверхности с абсолютной интенсивностью в качестве порога для обнаружения бета-клеток

Измерение уровня глюкозы в крови и человеческого инсулина

Кровь был получен путем надрезания хвостовой жилки. Глюкозу измеряли с помощью глюкометра AlphaTrak2 (Abbott, Alameda, CA). Человеческий инсулин в плазме измеряли с использованием набора ELISA для человеческого инсулина (Mercodia, Winston Salem, NC).

Ki67 трансплантата островков человека и иммуногистохимия инсулина

Иммуномечение тканей для Ki67 (MA5-14520, Thermo Scientific) и инсулина или глюкагона проводили на фиксированных формалином и залитых в парафин срезах с нейтральным буфером, как подробно описано ранее (1–3).

Статистика

Данные представлены как средние значения ± SE.Статистический анализ выполняли с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с post hoc HSD Тьюки или Холма (http://astatsa.com) для сравнения между группами. P <0,05 считалось статистически значимым.

Декларации интересов

Для A.F.S., K.K., R.J.D. и A.G-O .: Медицинская школа Икана подала патенты на описанную здесь работу. S.A.S – названный изобретатель интеллектуальной собственности «Композиции и методы для модуляции клеточной активности», соучредитель, консультирует и имеет долю в частной компании Redpin Therapeutics (компания доклинической стадии генной терапии, разрабатывающая технологии нейромодуляции).

Вклад авторов

A.G.-O., S.A.S., R.J.D и A.F. S. разработали исследования, руководили экспериментами и написали рукопись. C.R., A.A., P.W., Y.L. и K.K. выполнил исследования.

Благодарности

Мы благодарим семью Бонни и Джоэла Бергстайнов, а также семьи Лонни и Томаса Шварцев за их постоянную поддержку. Мы благодарим JDRF, поддерживаемую NIDDK DRC Einstein-Sinai и Human Adenovirus and Islet Core, The Mount Sinai Imaging Core за использование и поддержку световой микроскопии, NIDDK Integrated Islet Distribution Program и Prodo Labs.для снабжения островков трупов человека. Работа поддержана грантами JDRF 2-SRA-2017 514-SB и грантами NIH P-30 DK 020541, R-01 DK116873, R-01 DK116904, R-01 DK125285, R01 DK105015, R-01 DK-113079, R01 NS097184 и OT2 OD024912, грант NSF (1930157), Грант Американской диабетической ассоциации «Путь к остановке диабета» ADA № 1-17-ACE-31, экспериментальный грант Института здоровья и развития детей Mindich и выдающийся ученый Медицинской школы Икана награда. А.А. поддерживается докторской стипендией Фонда Чарльза Х. Ревсона и Шведского общества медицинских исследований (SSMF).

Алкалоиды Banisteriopsis caapi, растительный источник амазонского галлюциногена аяхуаски, стимулируют нейрогенез взрослых in vitro.

1.

Schultes, R.E. Ботаника и химия галлюциногенов. (Томас, 1980).

2.

Маккенна Д. и Риба Дж. Триптаминовые галлюциногены Нового Света и нейробиология Аяуаски. Курр . Верх . Поведение . Neurosci . DOI: 10.1007 / 7854_2016_472 (2017).

3.

Таппер, К. В. Глобализация аяхуаски: снижение вреда или максимизация пользы? Внутр. J. Политика в отношении наркотиков
19 , 297–303 (2008).

Артикул
PubMed

Google ученый

4.

Риба, Дж. Фармакология человека Аяуаски. (Автономный университет Барселоны, 2003 г.).

5.

Бакгольц, Н. С. и Богган, В. О. Ингибирование моноаминоксидазы в мозге и печени, продуцируемой бета-карболинами: взаимосвязь структура-активность и специфичность субстрата. Biochem. Pharmacol.
26 , 1991–1996 (1977).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

6.

Бакгольц, Н. С. и Богган, В. О. Ингибирование бета-карболинами захвата моноаминов синаптосомным препаратом: взаимосвязь структура-активность. Life Sci.
20 , 2093–2099 (1977).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

7.

Спрус, Р. Записки ботаника об Амазонке и Андах 2 (Macmillan, 1908).

8.

Отт, J. Pharmacotheon: энтеогенные препараты, их растительные источники и история. (Natural Products Co, 1993).

9.

Рэй Т.С. Психоделики и рецептор человека. PloS One
5 , e9019 (2010).

ADS
Статья
PubMed
PubMed Central

Google ученый

10.

Domínguez-Clavé, E. et al. . Аяуаска: фармакология, нейробиология и терапевтический потенциал. Brain Res. Бык.
126 , 89–101 (2016).

Артикул
PubMed

Google ученый

11.

Осорио, Ф. де Л. и др. . Антидепрессивные эффекты однократной дозы аяхуаски у пациентов с рецидивирующей депрессией: предварительный отчет. Ред. Бюстгальтеры. Psiquiatr.Сан-Паулу-Браз. 1999
37 , 13–20 (2015).

Google ученый

12.

Санчес Р.Ф. и др. . Антидепрессивные эффекты однократной дозы аяхуаски у пациентов с рецидивирующей депрессией: исследование SPECT. J. Clin. Psychopharmacol.
36 , 77–81 (2016).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

13.

Сесса, Б. Возрождение психоделических исследований. Lancet Lond. Англ.
380 , 200–201 (2012).

Артикул

Google ученый

14.

Ривье, Л. и Линдгрен, Дж. Э. «Аяхуаска», южноамериканский галлюциногенный напиток: этноботаническое и химическое исследование. Экон. Бот.
26 , 101–129 (1972).

CAS
Статья

Google ученый

15.

Маккенна, Д. Дж., Тауэрс, Г. Х. и Эбботт, Ф. Ингибиторы моноаминоксидазы в южноамериканских галлюциногенных растениях: триптамин и бета-карболин, составляющие аяхуаски. J. Ethnopharmacol.
10 , 195–223 (1984).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

16.

Callaway, J. C. Различные профили алкалоидов в отварах Banisteriopsis caapi. J. Психоактивные препараты
37 , 151–155 (2005).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

17.

Фарзин Д. и Мансури Н. Антидепрессантоподобный эффект гармана и других бета-карболинов в тесте принудительного плавания на мышах. евро. Neuropsychopharmacol. J. Eur. Coll. Neuropsychopharmacol.
16 , 324–328 (2006).

CAS
Статья

Google ученый

19.

Пик-Тейлор, А. и др. . Поведенческие и нейротоксические эффекты настоя аяхуаски (Banisteriopsis caapi и Psychotria viridis) у самок крыс Wistar. Behav. Процессы
118 , 102–110 (2015).

Артикул
PubMed

Google ученый

20.

Lima, L.-M. и др. . Les effets de l’ayahuasca sur le système nerveux central: étude comportementale. Фитотерапия
5 , 254–257 (2007).

CAS
Статья

Google ученый

21.

Фортунато, Дж. Дж. и др. . Хроническое введение гармина вызывает эффекты, подобные антидепрессантам, и увеличивает уровни BDNF в гиппокампе крыс. Дж . Нейронная передача . Вена, Австрия 1996
117 , 1131–1137 (2010).

CAS

Google ученый

22.

Юн, С., Рейнольдс, Р. П., Масиулис, И. и Эйш, А. Дж. Переоценка связи между психоневрологическими расстройствами и дисрегулируемым нейрогенезом взрослых. Нац. Med.
22 , 1239–1247 (2016).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

24.

Темпл, С. Пластичность стволовых клеток – построение мозга нашей мечты. Нац. Rev. Neurosci.
2 , 513–520 (2001).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

25.

Гонсалвес, Дж. Т., Шафер, С. Т. и Гейдж, Ф. Х. Нейрогенез взрослых в гиппокампе: от стволовых клеток к поведению. Ячейка
167 , 897–914 (2016).

Артикул
PubMed

Google ученый

27.

Boldrini, M. et al . Антидепрессанты увеличивают количество нервных клеток-предшественников в гиппокампе человека. Neuropsychopharmacol.Выключенный. Publ. Являюсь. Coll. Neuropsychopharmacol.
34 , 2376–2389 (2009).

CAS
Статья

Google ученый

28.

Сакс, Б. Д. и Карон, М. Г. Хронический флуоксетин увеличивает экстрагиппокампальный нейрогенез у взрослых мышей. Инт . Дж . Нейропсихофармакол . Off . Sci . Дж . Сб. . Инт . Нейропсихофармакол . CINP
18 (2015).

29.

Риба, Дж. и др. . Фармакология аяхуаски человека: субъективные и сердечно-сосудистые эффекты, экскреция метаболитов моноаминов и фармакокинетика. J. Pharmacol. Exp. Ther.
306 , 73–83 (2003).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

30.

Риба, Дж., Макилхенни, Э. Х., Боусо, Дж. К. и Баркер, С. А. Метаболизм и распределение N, N-диметилтриптамина в моче после перорального приема и курения: сравнительное исследование. Тест на наркотики. Анальный.
7 , 401–406 (2015).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

31.

Риба, Дж., Макилхенни, Э. Х., Валле, М., Боусо, Дж. К. и Баркер, С. А. Метаболизм и распределение N, N-диметилтриптамина и алкалоидов гармалы после перорального приема аяхуаски. Тест на наркотики. Анальный.
4 , 610–616 (2012).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

32.

Hämmerle, B. et al . Временная экспрессия Mnb / Dyrk1a связывает выход из клеточного цикла и дифференцировку предшественников нейронов, индуцируя экспрессию p27KIP1 и подавляя передачу сигналов NOTCH. Dev. Camb. Англ.
138 , 2543–2554 (2011).

Google ученый

34.

Callaway, J. C. Быстрые и медленные метаболизаторы Hoasca. J. Психоактивные препараты
37 , 157–161 (2005).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

35.

Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z. & Lindvall, O. Замена нейронов эндогенными предшественниками в мозге взрослого человека после инсульта. Нац. Med.
8 , 963–970 (2002).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

37.

Моралес-Гарсия, Дж. А. и др. . Ингибирование фосфодиэстеразы 7 вызывает дофаминергический нейрогенез у гемипаркинсонических крыс. Стволовые клетки Пер. Med.
4 , 564–575 (2015).

CAS
Статья
PubMed
PubMed Central

Google ученый

38.

Альварес-Буйлла, А. и Лим, Д.А. В долгосрочной перспективе: поддержание зародышевых ниш в мозге взрослого человека. Нейрон
41 , 683–686 (2004).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

39.

Ли, Д. К., Сонг, Х., Коламарино, С. А., Минг, Г. и Гейдж, Ф. Х. Нейрогенез во взрослом мозге: новые стратегии при заболеваниях центральной нервной системы. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.
44 , 399–421 (2004).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

40.

Wada, K. et al . Лейкотриен B4 и липоксин A4 являются регуляторными сигналами для пролиферации и дифференцировки нервных стволовых клеток. FASEB J. Off. Publ. Кормили. Являюсь. Soc. Exp. Биол.
20 , 1785–1792 (2006).

CAS

Google ученый

42.

Брессан Р. Б. и др. . EGF-FGF2 стимулирует пролиферацию и улучшает связывание нейронов стволовыми клетками эпидермального нервного гребня мыши (EPI-NCSC). Exp. Cell Res.
327 , 37–47 (2014).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

43.

Chen, S.-Q., Cai, Q., Shen, Y.-Y., Cai, X.-Y. И Лей, Х.-Й. Комбинированное использование NGF / BDNF / bFGF способствует пролиферации и дифференцировке нервных стволовых клеток in vitro . Внутр. J. Dev. Neurosci. Выключенный. J. Int. Soc. Dev. Neurosci.
38 , 74–78 (2014).

CAS
Статья

Google ученый

44.

Ян, К. Х., Левеск, М., Клэкстон, С., Джонсон, Р. Л. и Энг, С.-L. Lmx1a и lmx1b действуют совместно, регулируя пролиферацию, спецификацию и дифференцировку дофаминергических предшественников среднего мозга. J. Neurosci. Выключенный. J. Soc. Neurosci.
31 , 12413–12425 (2011).

CAS
Статья

Google ученый

45.

Santarelli, L. et al . Необходимость нейрогенеза гиппокампа для поведенческих эффектов антидепрессантов. Наука
301 , 805–809 (2003).

ADS
CAS
Статья
PubMed

Google ученый

46.

Сонг, Н.-Н. и др. . Снижение центрального серотонина во взрослом возрасте способствует нейрогенезу гиппокампа. Sci. Реп.
6 , 20338 (2016).

ADS
CAS
Статья
PubMed
PubMed Central

Google ученый

47.

Hui, J. et al. .Флуоксетин регулирует нейрогенез in vitro посредством модуляции передачи сигналов GSK-3β / β-катенина. Инт . Дж . Нейропсихофармакол
18 (2015).

48.

Taliaz, D., Stall, N. , Dar, D. E. и Zangen, A. Нокаут нейротрофического фактора мозга в определенных участках мозга ускоряет поведение, связанное с депрессией, и снижает нейрогенез. Мол. Психиатрия
15 , 80–92 (2010).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

49.

Warner-Schmidt, J. L. & Duman, R. S. VEGF является важным медиатором нейрогенного и поведенческого действия антидепрессантов. Proc. Natl. Акад. Sci. США
104 , 4647–4652 (2007).

ADS
CAS
Статья
PubMed
PubMed Central

Google ученый

50.

Anacker, C. et al . Антидепрессанты усиливают нейрогенез в гиппокампе человека, активируя рецептор глюкокортикоидов. Мол. Психиатрия
16 , 738–750 (2011).

CAS
Статья
PubMed
PubMed Central

Google ученый

51.

Hill, A. S., Sahay, A. & Hen, R. Увеличение нейрогенеза гиппокампа у взрослых достаточно для снижения тревожности и депрессивного поведения. Нейропсихофармакология
40 , 2368–2378 (2015).

CAS
Статья
PubMed
PubMed Central

Google ученый

52.

Маркуссен, А. Б., Флагстад, П., Кристьянсен, П. Э. Г., Йохансен, Ф. Ф. и Энглунд, У. Повышение нейрогенеза и улучшение поведения после хронического лечения флуоксетином у крыс Вистар. Acta Neurol. Сканд.
117 , 94–100 (2008).

CAS
PubMed

Google ученый

53.

Morais, M. et al . Эффекты хронического стресса на нейрогенез взрослого гиппокампа и пластичность дендритов обращаются селективным ингибированием МАО-А. J. Psychopharmacol. Oxf. Англ.
28 , 1178–1183 (2014).

Артикул

Google ученый

54.

Перера Т.Д. и др. . Антидепрессант-индуцированный нейрогенез в гиппокампе взрослых нечеловеческих приматов. J. Neurosci. Выключенный. J. Soc. Neurosci.
27 , 4894–4901 (2007).

CAS
Статья

Google ученый

56.

Бейкер, С.А., Бейкер, К.A. & Hagg, T. Дофаминергические нигростриатные проекции регулируют пролиферацию нервных предшественников в субвентрикулярной зоне взрослых мышей. евро. J. Neurosci.
20 , 575–579 (2004).

Артикул
PubMed

Google ученый

57.

Höglinger, G.U. et al . Истощение запасов дофамина ухудшает пролиферацию клеток-предшественников при болезни Паркинсона. Нац. Neurosci.
7 , 726–735 (2004).

Артикул
PubMed

Google ученый

59.

Lennington, J. B. et al. . Дофаминовые нейроны среднего мозга, связанные с обработкой вознаграждения, иннервируют нейрогенную субвентрикулярную зону. J. Neurosci. Выключенный. J. Soc. Neurosci.
31 , 13078–13087 (2011).

CAS
Статья

Google ученый

60.

Luskin, M. B., Zigova, T., Soteres, B. J. & Stewart, R. R. Клетки-предшественники нейронов, происходящие из передней субвентрикулярной зоны переднего мозга новорожденных крыс, продолжают пролиферировать in vitro и экспрессировать нейрональный фенотип. Мол. Клетка. Neurosci.
8 , 351–366 (1997).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

61.

Гейдж, Ф. Х., Кемперманн, Г., Палмер, Т. Д., Петерсон, Д. А. и Рэй, Дж. Мультипотентные клетки-предшественники во взрослой зубчатой ​​извилине. J. Neurobiol.
36 , 249–266 (1998).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

62.

Кертис, М.А., Фаулл, Р.Л.М. и Эрикссон, П.С. Влияние нейродегенеративных заболеваний на субвентрикулярную зону. Нац. Rev. Neurosci.
8 , 712–723 (2007).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

64.

Томас, Г., Лукас, П., Каплер, Н. Р., Таппер, К. В. и Мартин, Г. Терапия от зависимости с помощью Аяхуаски: результаты предварительного обсервационного исследования в Канаде. Curr. Злоупотребление наркотиками Rev.
6 , 30–42 (2013).

Артикул
PubMed

Google ученый

65.

Vaquero, L. и др. . Кокаиновая зависимость связана с аномальной префронтальной функцией, повышенной связностью полосатого тела и чувствительностью к денежным стимулам, а также снижением связи вне рамок человеческого вознаграждения. Наркоман . Biol ., DOI: 10.1111 / adb.12356 (2016).

66.

Волленвейдер Ф. X. и Кометр М. Нейробиология психоделических препаратов: значение для лечения расстройств настроения. Нац. Rev. Neurosci.
11 , 642–651 (2010).

CAS
Статья
PubMed

Google ученый

67.

Гриффитс Р. Р. и др. . Псилоцибин способствует значительному и устойчивому снижению депрессии и тревоги у пациентов с опасным для жизни раком: рандомизированное двойное слепое исследование. J. Psychopharmacol. Oxf. Англ.
30 , 1181–1197 (2016).

Артикул

Google ученый

69.

de la Fuente Revenga, M. et al . Оценка нейрогенного потенциала и фармакологическая характеристика 6-метокси-1,2,3,4-тетрагидро-β-карболина (пинолина) и гибридов мелатонин-пинолин. ACS Chem. Neurosci.
6 , 800–810 (2015).

Артикул
PubMed

Google ученый

70.

Моралес-Гарсия, Дж. А. и др. . Ингибирование киназы гликоген-синтазы 3 способствует нейрогенезу гиппокампа взрослых in vitro и in vivo . ACS Chem. Neurosci.
3 , 963–971 (2012).

CAS
Статья
PubMed
PubMed Central

Google ученый

71.

Шенберг, Э. Э. и др. . Острые двухфазные эффекты аяхуаски. PloS One
10 , e0137202 (2015).

Артикул
PubMed
PubMed Central

Google ученый

гармин

Хармин – алкалоид гармалы, принадлежащий к семейству соединений бета-карболина. Он встречается у ряда различных растений, в первую очередь у ближневосточного растения гармал или сирийской руты ( Peganum harmala ) и южноамериканского винограда Banisteriopsis caapi («яге», «аяхуаска»). Гармин – обратимый ингибитор моноаминоксидазы (ингибитор МАО или ИМАО) и стимулятор ЦНС. Он подавляет МАО-А, но не влияет на МАО-В. [2] Рекомендуемые дополнительные знания использует Как ингибитор МАО, гармин подавляет расщепление моноаминов ферментами, называемыми моноаминоксидазами. Моноамины включают нейротрансмиттеры (серотонин, дофамин), гормоны (мелатонин) и лекарства, включая многие галлюциногены (псилоцибин, диметилтриптамин (DMT), мескалин).Замедляя распад нейротрансмиттеров, ИМАО могут помочь восполнить запасы этих химических веществ в организме, и многие ИМАО используются в качестве антидепрессантов. Хармин не был предметом большого количества клинических исследований по лечению депрессии, что может быть частично связано с его ограниченным юридическим статусом во многих странах, а также существованием синтетических ИМАО с меньшим количеством побочных эффектов. P. harmala и B. caapi традиционно используются из-за их психоактивных эффектов. B. caapi традиционно используется вместе с растениями, содержащими наркотик ДМТ. Традиционно B. caapi употребляют как напиток с растениями, несущими ДМТ, или без них (см. Аяуаска). Обычно ДМТ не активен при пероральном приеме, но пользователи сообщают о совершенно разных эффектах, когда ДМТ присутствует в таких напитках. Гармин и вещества, содержащие его, используются современными экспериментаторами вместе со многими другими лекарствами. Многие галлюциногены проявляют повышенную активность при таком использовании. Хармин также является полезным флуоресцентным индикатором pH. По мере того, как pH окружающей среды увеличивается, флуоресцентное излучение гармина уменьшается. Побочные эффекты Важно отметить, что в отличие от синтетических фармацевтических ИМАО, таких как фенелзин, гармин обратим и селективен, что означает, что он не имеет почти такого высокого риска «сырного синдрома», вызванного употреблением тираминсодержащих продуктов, что является риском, связанным с фармацевтические ИМАО иногда (по ошибке) применяют ко всем ингибиторам МАО. [3] Гармин и растения, содержащие значительное количество гармина и других алкалоидов гармалы, обычно не считаются безопасными лекарствами от депрессии в медицинском сообществе. [4] Природные источники Гармин содержится в большом количестве различных организмов, большинство из которых являются растениями. Shulgin (1997) [5] перечисляет около тридцати различных видов, которые, как известно, содержат гармин, включая семь видов бабочек из семейства Nymphalidae.Перечисленные растения, содержащие гармин, включают табак, два вида маракуйи / маракуйи и многие другие. Помимо B. caapi , по крайней мере, три представителя Malpighiaceae содержат гармин, в том числе еще два вида Banisteriopsis и растение Callaeum antifebrile . Каллавей, Брито и Невес (2005) [6] обнаружили уровни гармина 0,31-8,43% в образцах B. caapi . Семейство Zygophyllaceae, к которому принадлежит гармал, включает как минимум два других растения, несущих гармин: Peganum nigellastrum и Zygophyllum fabago . Callaway JC, Brito GS & Neves ES (2005). Фитохимический анализ Banisteriopsis caapi и Psychotria viridis. Журнал психоактивных препаратов 37 (2): 145-150. Лекарства от TiHKAL AL-LAD • DBT • DET • DiPT • 5-МеО-α-МТ • DMT • 2, α-ДМТ • α, N-DMT • DPT • EiPT • α-ET • ETH-LAD • Гармалин • Хармин • 4-HO-DBT • 4-HO-DET • 4-НО-ДИПТ • 4-НО-ДМТ • 5-HO-DMT • 4-HO-DPT • 4-HO-MET • 4-НО-МИПТ • 4-HO-MPT • 4-НО-пир-Т • Ибогаин • LSD • ОБТ • 4,5-МДО-ДиПТ • 5,6-МДО-ДиПТ • 4,5-МДО-ДМТ • 5,6-МДО-ДМТ • 5,6-МДО-МиПТ • 2-Me-DET • 2-Me-DMT • Мелатонин • 5-MeO-DET • 5-MeO-DiPT • 5-MeO-DMT • 4-MeO-MiPT • 5-MeO-MiPT • 5,6-MeO-MiPT • 5-MeO-NMT • 5-МеО-пир-Т • 6-MeO-THH • 5-MeO-TMT • 5-MeS-DMT • MiPT • α-МТ • СЕТЬ • NMT • ПРО-ЛАД • пир-Т • Триптамин • Тетрагидрогармин • α, N, О-ТМС

Гармин и гармалин подавляют индуцированный TCDD Cyp1a1 в печени и легких мышей C57BL / 6

Ранее мы продемонстрировали, что Peganum harmala L. экстракт и его основные активные компоненты, гармин и гармалин, ингибируют опосредованную 2,3,7,8-тетрахлордибензо- p -диоксином (TCDD) индукцию канцерогенно-активирующего фермента Cyp1a1, in vitro . Однако влияние обоих алкалоидов на Cyp1a1 in vivo не исследовалось. Таким образом, цель этого исследования – изучить влияние гармина и гармалина на TCDD-опосредованную индукцию Cyp1a1 в печени и легких мышей. Мышей-самцов C57BL / 6 разделили на четыре группы ().Первая группа получила транспортное средство, а вторая группа получила TCDD (i.p.). Третья и четвертая группы получали либо гармин, либо гармалин (i.p.) × 3 раза вместе с TCDD один раз со средней дозой гармина и гармалина. Всех мышей умерщвляли через 14 часов после инъекции TCDD и выделяли печень и легкие. Влияние гармина и гармалина на TCDD-опосредованную индукцию мРНК Cyp1a1, белка и уровни активности определяли с использованием ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинга и 7-этоксирезурофина в качестве субстрата соответственно. Наши результаты показали, что гармин и гармалин значительно снижают TCDD-опосредованную индукцию Cyp1a1 как в печени, так и в легких. Мы пришли к выводу, что гармин и гармалин являются многообещающими кандидатами для ингибирования TCDD-опосредованной индукции Cyp1a1 в печени и внепеченочных тканях мышей.

1. Введение

2,3,7,8-Тетрахлордибензо- p -диоксин (TCDD) – широко распространенный загрязнитель окружающей среды, который обладает множественными побочными эффектами, специфичными для различных видов и тканей, такими как распространение опухоли, тератогенность и иммунная, гепато-, кардио- и кожная токсичность.TCDD является известным канцерогеном для животных и людей, и с 1997 года он был классифицирован Международным агентством по изучению рака (IARC) как канцероген для человека (группа 1). В 2009 году IARC подтвердил, что TCDD является канцерогеном для человека, который коррелирует с повышенная смертность от всех видов рака человека вместе взятых [1].

Неблагоприятные эффекты TCDD в основном опосредованы связыванием и активацией универсального фактора транскрипции, называемого арилуглеводородным рецептором (AhR). AhR неактивен в цитоплазме до тех пор, пока не свяжется со своим лигандом, таким как TCDD.После связывания лиганда AhR активируется и перемещается в ядро, где он гетеродимеризуется с другим белком, называемым ядерным транслокатором AhR (ARNT). Образованный комплекс связывается со своей родственной последовательностью ДНК, которая находится выше нескольких генов, регулируемых AhR, включая CYP1A1 [2].

CYP1A1 – фермент, активирующий канцерогены, который катализирует метаболическую активацию некоторых проканцерогенов до их окончательных канцерогенных форм. Активность CYP1A1 коррелирует не только с воздействием нескольких загрязнителей окружающей среды, таких как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), но и с активацией нескольких проканцерогенных агентов [3].Более того, несколько исследований продемонстрировали положительную взаимосвязь между индукцией CYP1A1 и заболеваемостью несколькими видами рака человека, такими как рак легких, толстой кишки и прямой кишки [4, 5]. Кроме того, было продемонстрировано, что ингибирование активности AhR и его регулируемого гена CYP1A1 может привести к предотвращению токсических эффектов, вызываемых лигандами AhR, включая канцерогенность [6].

Гармин, 7-метокси-1-метил-9H-пиридо (3,4-b) индол и гармалин, 4,9-дигидро-7-метокси-1-метил-3H-пиридо (3,4-b) индол (рис. 1) – это обычные алкалоиды карболина, которые присутствуют в нескольких растениях, таких как Peganum harmala L .(Nitrariaceae). Гармин и гармалин обладают несколькими фармакологическими эффектами, такими как гипотермические, противомикробные, антиоксидантные, галлюциногенные, цитотоксические и противоопухолевые свойства [7]. Ранее мы продемонстрировали, что экстракт Peganum harmala и его основные активные компоненты, гармин и гармалин снижали TCDD-опосредованную индукцию активности Cyp1a1 в клетках гепатомы мыши Hepa-1c1c7 [8]. Более того, мы сообщили, что и гармин, и гармалин ингибировали TCDD-опосредованную индукцию канцероген-активирующего фермента CYP1A1 в клетках гепатомы человека HepG2 посредством транскрипционных и посттрансляционных механизмов [9, 10].Однако влияние обоих алкалоидов на Cyp1a1 in vivo еще предстоит изучить. Таким образом, цель этого исследования – изучить влияние гармина и гармалина на TCDD-опосредованную индукцию Cyp1a1 в печени и легких мышей.

2. Материалы и методы

2.1. Химические вещества и реагенты

Хармина гидрохлорид (чистота> 98%) и 7-этоксирезоруфин (7ER) были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури). TRIzol был получен от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния).Первичное антитело против Cyp1a, первичный кроличий антимышиный актин и вторичные антитела козьего антитела против пероксидазы IgG кролика были приобретены в Санта-Круз (Санта-Крус, Калифорния). TCDD с чистотой> 99% был получен из Cambridge Isotope Laboratories (Woburn, MA). Дигидрат гидрохлорида гармалина (чистота> 90%) был поставлен компанией ACROS Organics (Моррис Плейнс, Нью-Джерси). Вторичные антитела к пероксидазе IgG козы против мыши были приобретены в R&D Systems (Миннеаполис, Миннесота). Набор для обратной транскрипции кДНК высокой емкости и мастер-смесь для ПЦР SYBR Green были получены от Applied Biosystems (Фостер-Сити, Калифорния).Нитроцеллюлозные мембраны были приобретены у Bio-Rad (Геркулес, Калифорния). Реагенты для определения хемилюминесценции Вестерн-блоттингом были получены от GE Healthcare Life Sciences (Пискатауэй, Нью-Джерси). Праймеры были приобретены в компании Integrated DNA technologies (IDT, Coralville, IA). Все остальные химические вещества были закуплены у Fisher Scientific (Торонто, Онтарио).

2.2. Животные

Все экспериментальные процедуры с участием животных были одобрены Комитетом по политике и благополучию животных Университета Альберты.Двадцать четыре мышей-самцов C57BL / 6 массой 20-25 г были получены из Charles River Canada (Сент-Констант, Квебек, Канада). Все животные подвергались 12-часовым циклам свет / темнота и имели свободный доступ к пище и воде.

2.3. Лечение мышей и выделение тканей

Двадцать четыре самца мышей C57BL / 6 случайным образом разделили на четыре группы (). Первая группа служила контролем с подобранным весом и получала такой же объем носителя в указанные моменты времени. Вторая группа получала внутрибрюшинное лечение (т. p.) с TCDD (15 г / кг), растворенным в кукурузном масле в течение 0 часов. Третью и четвертую группы обрабатывали либо гидрохлоридом гармина, либо гидрохлоридом гармалина (10 мг / кг, внутрибрюшинно), растворенным в физиологическом растворе, с обработкой ультразвуком и нагреванием в течение 30 минут при 40 ° C и TCDD (15 г / кг, внутрибрюшинно). Гидрохлорид гармина и гидрохлорид гармалина вводили мышам при -4, 0 и +4 ч, тогда как TCDD обрабатывали один раз в 0 ч (таблица 1). Все животные были умерщвлены смещением шейных позвонков через +14 ч после обработки TCDD.Ткани печени и легких были вырезаны и разделены на две отдельные части; одну меньшую часть оставляли для выделения полной РНК, а большую часть использовали для выделения микросомальной фракции, немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до анализа.

Группы лечения Время (час) −4 0 +414 9124 9123 9123 9123 9123 9123 9123 9123 Группа 1 Физиологический раствор Физиологический раствор + кукурузное масло Физиологический раствор жертвоприношение Группа 2 Физиологический раствор Физиологический раствор + ТХДД (15 мк г / кг) Группа 3 Гармин (10 мг / кг) Гармин (10 мг / кг) + TCDD (15 μ г / кг) Гармин (10 мг / кг) жертвоприношение Группа 4 Хармалин (10 мг / кг) Гармалин (10 мг / кг) + TCDD (15 мкг / г / кг) Гармалин (10 мг / кг) жертвоприношение

2.

4. Выделение РНК и синтез кДНК

Суммарную РНК выделяли из замороженных тканей с использованием реагента TRIzol в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen) и определяли количественно путем измерения оптической плотности при 260 нм. Качество РНК определяли путем измерения отношения 260/280, и кДНК первой цепи синтезировали с использованием набора для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (Applied Biosystems) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, 1,5 г общей РНК из каждого образца добавляли к смеси 2.0 л 10Х буфера обратной транскриптазы, 0,8 л 25Х смеси dNTP (100 мМ), 2,0 л 10Х случайных праймеров обратной транскриптазы, 1,0 л обратной транскриптазы MultiScribe и 4,2 л воды, свободной от нуклеаз. Конечную реакционную смесь выдерживали при 25 ° C в течение 10 минут, нагревали до 37 ° C в течение 120 минут, нагревали до 85 ° C в течение 5 с и, наконец, охлаждали до 4 ° C [11].

2,5. Количественная оценка экспрессии мРНК с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР в реальном времени)

Реакции ПЦР в реальном времени проводили с использованием системы ABI 7500 (Applied Biosystems, Inc. , Фостер-Сити, Калифорния), как описано ранее [12]. Праймеры, использованные в данном исследовании, были выбраны из ранее опубликованных исследований [8, 13] и были приобретены у Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA). Cyp1a1 мыши: прямой праймер 5′-GGT TAA CCA TGA CCG GGA ACT-3 ‘, обратный праймер 5′-TGC CCA AAC CAA AGA GAG TGA-3′ и мышь 18S: прямой праймер 5’-GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT-3 ‘, обратный праймер 5′-CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG-3’. Контроли для анализа были включены в тот же планшет, а именно контроли без матрицы для тестирования на загрязнение любых реагентов для анализа.Данные ПЦР в реальном времени анализировали с использованием метода относительной экспрессии генов (), как описано в бюллетене № 2 для пользователей Applied Biosystems [14].

2.6. Выделение микросомальной фракции и вестерн-блоттинг

Фракции микросом печени и легких выделяли, как описано ранее [15]. Вкратце, замороженные ткани разрезали на мелкие кусочки и отдельно гомогенизировали в холодном растворе сахарозы (1 г ткани в 5 мл 0,25 М сахарозы). После этого микросомальные фракции разделяли с использованием процесса дифференциального ультрацентрифугирования.Полученные гранулы микросом восстанавливали в ледяном растворе сахарозы и хранили при -80 ° C до использования. Содержание белка в каждой микросомальной фракции определяли методом Лоури, используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта [16]. Вестерн-блоттинг выполняли, как описано ранее [8]. Вкратце, микросомальные белки (2 г) загружали в 10% SDS-PAGE и электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Белковые блоты блокировали в течение 24 часов при 4 ° C в блокирующем буфере (5% сухого обезжиренного молока, 2% бычьего сывороточного альбумина и 0.05% (об. / Об.) Твин 20 в трис-буферном физиологическом растворе (0,15 М хлорид натрия, 3 мМ хлорид калия и 25 мМ Трис-основание)). После этого белковые блоты инкубировали с первичным антимышиным антителом Cyp1a в течение 2 часов при комнатной температуре или с первичным кроличьим антимышиным актином в течение 24 часов при 4 ° C. Наконец, мембраны инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой, в течение еще 1 часа, а именно с козьим антителом против мыши к Cyp1a или козьим антителом против кроличьего IgG для обнаружения актина. Образованные полосы визуализировали с помощью метода усиленной хемилюминесценции в соответствии с инструкциями производителя (GE Healthcare, Piscataway, NJ).Интенсивность белковых полос была определена количественно относительно сигналов, полученных для белка актина с использованием программного обеспечения для обработки изображений на основе Java, ImageJ (W. Rasband (2005) Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, http: //rsb.info.nih .gov / ij /).

2.7. Инкубация микросом и определение ферментативной активности Cyp1a1

Микросомы из печени (0,25 мг / мл) или легких (0,15 мг / мл) суспендировали в инкубационном буфере, содержащем 3 мМ гексагидрата хлорида магния, растворенного в 0,5 М калий-фосфатном буфере, pH 7.4 при 37 ° C на водяной бане со встряхиванием (100 об / мин). 7-Этоксирезоруфин использовали в качестве субстрата, и его конечная концентрация составляла 2 М. Период предварительного уравновешивания в течение 5 минут выполнялся перед инициированием реакции с 1 мМ НАДФН. После инкубационного периода 3 мин для микросом печени и 30 мин для микросом легких реакцию останавливали добавлением 1 мл ледяного метанола. Реакцию проводили в двух экземплярах, используя реакционную смесь без НАДФН в качестве холостого опыта для каждого образца микросом. Количество резоруфина в супернатанте каждой реакционной смеси определяли с использованием 96-луночного считывающего устройства для флуоресцентных планшетов Baxter, используя длины волн возбуждения и эмиссии 545 и 575 нм, соответственно.Образование резоруфина было линейным в зависимости от времени инкубации и количества белка. Количество резоруфина рассчитывали с использованием стандартной кривой известных концентраций резоруфина, а конечное количество рассчитывали путем вычитания количества резоруфина, образованного в каждой контрольной смеси, из соответствующей реакционной смеси. Конечная ферментативная активность выражалась в пикомолях резоруфина, образовавшихся за минуту, и на миллиграмм микросомальных белков.

2,8. Статистический анализ

Все результаты представлены как среднее ± S.E.M., и статистические различия между группами лечения определяли с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Стьюдента-Ньюмана-Кеулса с использованием программы SigmaStat 3.5 для Windows, Systat Software Inc. (Сан-Хосе, Калифорния).

3. Результаты

3.1. Влияние гармина и гармалина на мРНК Cyp1a1, белок и ферментативную активность в печени мышей C57BL / 6

Наши результаты показали, что обработка мышей TCDD значительно повышала уровень мРНК Cyp1a1 примерно на 200000% по сравнению с контрольной группой.Более того, лечение гармином значительно снизило опосредованную TCDD индукцию экспрессии мРНК Cyp1a1 на 15% (рис. 2 (а)).

Чтобы проверить, транслируется ли действие гармина на мРНК Cyp1a1 печени в релевантный эффект на уровне белков и ферментативной активности, микросомальные фракции были выделены из печени, и влияние гармина на белок Cyp1a и ферментативную активность Cyp1a1 было определено с помощью Вестерн-блот-анализа. и 7ER в качестве подложки соответственно. Наши результаты показали, что TCDD индуцировал белок Cyp1a на 250% по сравнению с контрольной группой.С другой стороны, лечение гармином значительно снизило TCDD-опосредованную индукцию белка Cyp1a на 17% (рис. 2 (b)). Более того, TCDD индуцировал ферментативную активность Cyp1a1 на 2000% по сравнению с контрольной группой, тогда как обработка гармином значительно снижала TCDD-опосредованную Cyp1a1-зависимую ферментативную активность на 60% (рис. 2 (c)).

С другой стороны, наши результаты показали, что гармалин снижает уровень TCDD-опосредованной индукции экспрессии мРНК Cyp1a1 на 9%; однако эффект не был значительным (рис. 3 (а)).Кроме того, гармалин значительно снижал ферментативную активность Cyp1a на 20% и ферментативную активность Cyp1a1 на 32% при использовании вестерн-блоттинга и 7ER в качестве субстрата, соответственно (Фигуры 3 (b) и 3 (c)). В совокупности оба алкалоида снижали TCDD-опосредованную индукцию Cyp1a1 в тканях печени; однако гармин показал более выраженный эффект, особенно на уровне ферментативной активности Cyp1a1 (таблица 2).

9123 967 967 967 967 TCDD-967 967 967 967 TCDD-1330 912 Cy1367 930 967 967 967 967 967 967 930 967 967 967 967 930 967 967 967 930 44 930 967 91 269 ​​ Cyrmine Harmaline 15% 9% (ii) Белок Cyp1a 17% 20% (iii) Активность Cyp1a1 60% 4 9127 9127 91 32% TCDD-индуцированный Легкое (i) мРНК Cyp1a1 44% 34% (iii) Активность Cyp1a1 60% 40% 3. 2. Влияние гармина и гармалина на уровни мРНК, белка и ферментативной активности Cyp1a1 в легких мышей C57BL / 6 В попытке изучить, является ли действие гармина и гармалина неспецифическим для тканей печени, ткани легких были изолированы, и влияние обоих алкалоидов на TCDD-опосредованную индукцию Cyp1a1 определяли на уровнях мРНК, белка и ферментативной активности. Наши результаты показали, что TCDD значительно индуцировал экспрессию мРНК Cyp1a1 в легких на 43000% по сравнению с контрольной группой, тогда как гармин значительно снижал TCDD-опосредованную индукцию экспрессии мРНК Cyp1a1 в легких на 44% (рис. 4 (а)).Более того, TCDD вызывал индукцию легочного белка Cyp1a и ферментативной активности Cyp1a1 на 440% и 792% соответственно (рисунки 4 (b) и 4 (c)). С другой стороны, гармин значительно снижал TCDD-опосредованную индукцию легочного белка Cyp1a и ферментативную активность на 43% и 60% соответственно (рисунки 4 (b) и 4 (c)). Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что действие гармина на TCDD-опосредованный Cyp1a1 сходно в тканях печени и легких, особенно на уровне ферментативной активности Cyp1a1. Подобно гармину, мы проверили влияние гармалина на TCDD-опосредованную индукцию легочного Cyp1a1 на уровне мРНК, белка и ферментативной активности.Наши результаты показали, что гармалин снижает TCDD-опосредованную индукцию экспрессии мРНК Cyp1a1 в легких на 34% (рисунок 5 (a)), тогда как он значительно снижает TCDD-опосредованный белок Cyp1a и ферментативную активность Cyp1a1 на 44% и 40% соответственно (рисунки 5 (б) и 5 ​​(в)). Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что влияние гармалина на TCDD-опосредованную ферментативную активность Cyp1a1 почти одинаково в тканях легких и печени. Подобно ткани печени, гармин показал более выраженный эффект в снижении TCDD-опосредованной индукции ферментативной активности легкого Cyp1a1, чем эффект, наблюдаемый с гармалином (таблица 2). 4. Обсуждение Настоящее исследование впервые демонстрирует, что гармин и гармалин значительно снижают TCDD-опосредованную индукцию канцероген-активирующего фермента Cyp1a1 в печени и легких мышей C57BL / 6. Развитие рака – это многоступенчатый процесс, в котором задействовано несколько факторов. Унаследованные генетические факторы могут объяснить частоту 5–15% большинства видов рака, но среда и образ жизни являются основными факторами, способствующими развитию рака [17].TCDD – широко распространенный загрязнитель окружающей среды, который обычно выбрасывается в окружающую среду из нескольких источников, таких как установки для сжигания отходов, производство черных и цветных металлов, производство гербицидов и производство электроэнергии [18]. Несколько несчастных случаев и профессиональных воздействий на TCDD продемонстрировали роль TCDD в повышенном риске заболеваемости и смертности от рака [1]. TCDD является метаболически стабильным лигандом AhR, и некоторые побочные эффекты воздействия TCDD связаны с постоянной активацией сигнального пути AhR.С этой гипотезой согласуются результаты экспериментов с использованием трансгенных мышей, у которых функция AhR нарушена. Было продемонстрировано, что побочные эффекты, опосредованные TCDD, ослабляются у мышей с нарушенной функцией AhR [2, 19]. Большинство химических канцерогенов в окружающей среде химически инертны сами по себе и требуют метаболической активации ферментами цитохрома P450 (CYP) до более реактивных метаболитов, чтобы проявлять канцерогенность у экспериментальных животных и людей [20].Хорошо известно, что AhR регулирует многочисленные CYP, такие как CYP1A1, которые участвуют в метаболической активации нескольких проканцерогенов и их превращении в предельные канцерогенные формы [2]. В соответствии с этой гипотезой ранее сообщалось, что TCDD индуцирует экспрессию постоянного высокого уровня CYP1A1, что приводит к усилению метаболизма экзогенных и эндогенных химических веществ, генерации активных форм кислорода и вызывает окислительный стресс, что приводит к увеличению повреждения ДНК [2, 21 ].Более того, в недавних отчетах подчеркивается использование AhR в качестве мишени для новых химиопрофилактических агентов. В этом контексте несколько антагонистов AhR показали многообещающие результаты против многочисленных канцерогенных агентов. Ранее сообщалось, что генотоксичность, связанная с бензо (а) пиреном у мышей, ингибируется антагонистами AhR, такими как 3′-метокси-4′-нитрофлавон и ресвератрол [22, 23]. Гармин представляет собой ароматическое соединение -карболин, структурно сходное со своим дигидрокарболиновым аналогом, гармалином (рис. 1).Оба соединения встречаются в природе в нескольких растениях, таких как Peganum harmala , и обладают несколькими фармакологическими эффектами, включая противоопухолевые свойства. Гармин и гармалин метаболизируются в печени и внепеченочных тканях до их основных метаболитов, гармола и гармалола, соответственно, главным образом с помощью CYP2D6 и CYP1A2 (рис. 1) [24]. Ранее мы продемонстрировали, что и гармин, и гармалин способны ингибировать TCDD-опосредованную индукцию Cyp1a1 в клетках гепатомы мыши Hepa 1c1c7 [8].Более того, мы продемонстрировали, что оба соединения действуют как антагонисты AhR. Наконец, мы подтвердили, что гармин и гармалин обладают посттрансляционной модификацией, с помощью которой они снижают стабильность белка CYP1A1 в клетках гепатомы человека HepG2 [9, 10]. Таким образом, мы предположили, что действие гармина и гармалина можно транслировать in vivo на с использованием чувствительной линии мышей C57BL / 6. Более того, мы проверили, можно ли продемонстрировать эффект гармина и гармалина в других внепеченочных тканях, используя легкие в качестве репрезентативной ткани. В данном исследовании мы выбрали линию мышей C57BL / 6, поскольку она содержит чувствительный аллель AhR (AhR b ) [2]. Что касается выбора дозы TCDD, известно, что TCDD является метаболически стабильным соединением, и его период полураспада, как было ранее определено на мышах, составляет около 20 дней [25]. Несколько концентраций TCDD были исследованы ранее на предмет индукции Cyp1a1 и активации AhR в той же линии мышей, и было продемонстрировано, что 15 г / кг (i.p.) обеспечивает субмаксимальное насыщение / активацию AhR [26].Кроме того, дозы гармина и гармалина были выбраны в соответствии с их периодом полураспада. Ранее было продемонстрировано, что гармин обладает коротким периодом полураспада у грызунов, который, по оценкам, составляет около 20 минут, тогда как гармалин обладает относительно более длительным периодом полураспада, около 60 минут [27]. Поэтому мы подумали, что многократные дозы обоих алкалоидов будут полезны. Наиболее важно то, что 10 мг / кг массы тела для трех доз было выбрано на основе предварительных экспериментов, в которых мы не смогли обнаружить никакого эффекта при более низких дозах.С другой стороны, хорошо известно, что основными недостатками использования этих алкалоидов -карболина являются их побочные треморгенные эффекты [7]. В нашем исследовании слабый или умеренный тремор был обнаружен для гармина и гармалина в первой дозе с более сильным эффектом при приеме гармалина. Однако в последующих дозах эти толчки резко уменьшились. Выбор ткани печени в нашем исследовании обусловлен несколькими причинами. Во-первых, мы ранее изучили действие гармина и гармалина с использованием различных клеток гепатомы человека и мыши.Во-вторых, хорошо известно, что TCDD концентрируется в организме в основном в жировой ткани и печени [28]. TCDD секвестрируется в печени с помощью печеночно-специфических микросомальных связывающих белков [29]. В-третьих, активный AhR является важным фактором развития гепатоцеллюлярной токсичности, опосредованной TCDD [30]. Наконец, печень является местом максимального метаболизма и наибольшего количества ферментов CYP с максимальным уровнем индукции CYP1A1. С другой стороны, легкие были выбраны в нашем исследовании, потому что они являются одним из органов, наиболее подверженных воздействию загрязнителей окружающей среды из-за курения и загрязнителей воздуха.Кроме того, несколько исследований коррелировали индукцию ферментативной активности CYP1A1 с развитием рака легких [4]. В текущем исследовании гармин и гармалин значительно снижали TCDD-опосредованную индукцию Cyp1a1 в печени и легких мышей. Гармин проявил больший эффект, чем гармалин, как в печени, так и в тканях легких. Различия между действием гармина и гармалина можно объяснить двумя основными причинами. Во-первых, между обоими алкалоидами есть структурное различие.Гармин имеет ароматическую планарную структуру, которая может усиливать его связывающую способность с AhR, тогда как гармалин обладает компланарной структурой. В этом контексте мы ранее продемонстрировали, что гармин эффективно замещает радиоактивно меченый TCDD в тесте конкурентного связывания лигандов, тогда как гармалин показал умеренный эффект [9, 10]. Во-вторых, гармин и гармалин обладают разными фармакокинетическими параметрами. Было подсчитано, что способность гармина концентрироваться в легких выше, чем у гармалина у грызунов [27]. 5. Заключение Гармин и гармалин снижают TCDD-опосредованную индукцию канцероген-активирующего фермента Cyp1a1 в печени и легких мышей C57BL / 6. Эти данные являются первым доказательством того, что гармин и гармалин могут предотвращать неблагоприятное действие диоксинов и других лигандов AhR in vivo . Сокращения AhR: Арилуглеводородный рецептор CYP1A1: Цитохром P450 1A1 7ER: 67 7-Eur 8-Тетрахлордибензо- p -диоксин. Конфликт интересов Авторы заявили об отсутствии конфликта интересов. Благодарности Эта работа была поддержана Канадским советом по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC), грант RGPIN 250139, выданный А. О. С. Эль-Кади. М. А. М. Эль-Генди – получатель стипендии правительства Египта и докторской диссертации Университета Альберты. Хармина гидрохлорид | CAS 343-27-1 | SCBT Хармина гидрохлорид | CAS 343-27-1 | SCBT – Santa Cruz Biotechnology Гармина гидрохлорид CAS: 343-27-1 MF: C13h22N2O • HCl MW: 248.71 Дом Химические вещества Алкалоиды Хармина гидрохлорид Альтернативные имена: Гидрохлорид гармина также известен как гидрохлорид телепатина. Заявление: Хармина гидрохлорид – это флуоресцентный алкалоид гармалы и стимулятор ЦНС, содержащийся в Peganum harmala. Количество CAS: 343-27-1 Чистота: ≥98% Молекулярный вес: 248,71 Молекулярная формула: C 13 H 12 N 2 O • HCl Только для исследовательских целей. Не предназначено для диагностического или терапевтического использования. * Данные по партии (включая содержание воды) см. В Сертификате анализа. Нажмите на изображение или кнопку увеличения, чтобы увеличить Закрыть Хармина гидрохлорид – стимулятор ЦНС, относящийся к семейству бета-карболинов. Как флуоресцентный алкалоид гармалы, гидрохлорид гармина обладает высокой проницаемостью для клеток. Это качество делает гидрохлорид гармина высоко конкурентным ингибитором связывания АТФ с киназным карманом DYRK1A. Хармина гидрохлорид также ингибирует моноаминоксидазы и cdc-подобные киназы. Хармина гидрохлорид также может действовать как рецептор серотонина 5-HT2A. Ссылки 1. Slavica Filipic et. al Журнал хроматографической науки, 54 (7), undefined (2016-7-14) 2.Elisangela G Cata-Preta et. al Границы фармакологии, 9, не определено (2018-6-14) 3. Darija Obradović et. al Журнал хроматографии. A, 1603, undefined (2019-5-8) 4. Хаунер, Х. Механизм действия тиазолидиндионов. Исследования и обзоры диабета / метаболизма 18, S10-S15 (2002). 5. Waki, H., Park, K.W., Mitro, N., et al. Низкомолекулярный гармин представляет собой антидиабетический регулятор экспрессии PPARγ, специфичный для клеточного типа. Cell Metabolism 5, 357-370 (2007). Растворимость : Растворим в воде, метаноле и этаноле. Только для исследовательских целей. Не предназначено для диагностического или терапевтического использования. Номер в леях : MFCD00012641 Реестр Байльштейна : 23400 Улыбки : CC1 = NC = CC2 = C1NC3 = C2C = CC (= C3) OC.Cl Adobe Acrobat Reader требуется для надежного просмотра, печати и комментирования PDF-документов. Хармина гидрохлорид (CAS 343-27-1) Цитирование продуктов Посмотрите, как другие использовали гидрохлорид гармина (CAS 343-27-1).Щелкните запись, чтобы просмотреть запись в PubMed. . Цитирования 1 до 4 из 4 всего Цитирования 1 до 4 из 4 всего Оценка 5 из 5 к SF из Лю и др. Лю и др.(PubMed ID 23392846) обнаружили, что гидрохлорид гармина снижает жизнеспособность клеток глиобластомы, индуцирует апоптоз и предотвращает фосфорилирование Akt. -SCBT Обзор публикации Дата выпуска: 2015-06-23 Santa Cruz Biotechnology, Inc. – мировой лидер в разработке продуктов для рынка биомедицинских исследований. Позвоните нам по бесплатному телефону 1-800-457-3801 . Авторские права © 2007-2021 Santa Cruz Biotechnology, Inc.Все права защищены. “Santa Cruz Biotechnology” и логотип Santa Cruz Biotechnology, Inc., “Здоровье животных Санта-Крус”, “San Juan Ranch”, “Дополнение чемпионов”, логотип San Juan Ranch, “Ultracruz”, “Chemcruz”, ” Immunocruz »,« Exactacruz »и« EZ Touch »являются зарегистрированными товарными знаками Santa Cruz Biotechnology, Inc. Все товарные знаки являются собственностью соответствующих владельцев. Получена ваша подписка на рассылку новостей и объявлений по электронной почте. Регистрируясь, вы подтверждаете, что прочитали и согласны с условиями нашей политики конфиденциальности. Вы имеете право отказаться от подписки в любое время, щелкнув ссылку «отказаться от подписки» в любом полученном вами электронном письме с новостями и объявлениями. Чтобы разместить заказ с использованием юаней или отправить товар в континентальный Китай, посетите веб-сайт www.scbio.cn Гармин подавляет пролиферацию и миграцию клеток рака яичников человека путем ингибирования пути ERK / CREB Введение Рак яичников – шестая по частоте причина смерть от рака среди западных женщин. Хотя он представляет 30% случаев рака женских половых путей, рака яичников ответственны за более чем половину смертей (1). Значительный прогресс был достигнут в хирургия и улучшение химиотерапевтических средств в яичниках рак, который привел к увеличению 5-летней выживаемости, однако рак остается ведущей причиной смерти всех гинекологических раки (1,2). Основная проблема нынешнего химиотерапия для лечения рака яичников из-за лекарств сопротивление или рецидив. Таким образом, идентификация нового противоопухолевого лекарства и понимание лежащих в основе молекулярных механизмов будет очень помогает в лечении рака яичников. Натуральные продукты привлекли значительное внимание внимание из-за их мощного противоракового действия в прошлом десятилетия (3,4). По оценкам, более 46% новые лекарства и новые лекарственные препараты-кандидаты для лечения рака, одобренные США Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) с 1989 по 1995 гг. натуральные продукты или производные натуральных продуктов (5). Примечательно, что недавние исследования продемонстрировали, что бета-карболиновые алкалоиды, большая группа природные и синтетические индольные алкалоиды, широко присутствующие в экстракты из листьев, коры, корней и семян различных растения, обладают широким спектром психофармакологических и нейрофармакологические эффекты (6). Многие алкалоиды широко используются в клиническом лечении кашель, гипертония и воспаление. Среди них гармин (7-метокси-1-метил-9Hпиридо [3,4-b] индол), который первоначально был выделен из семян Peganum harmala и Banisteriopsis caapi и традиционно использовался как народный медицина на Ближнем Востоке, в Центральной Азии и Южной Америке (7), по-видимому, демонстрирует различные фармакологические эффекты как in vitro, так и in vivo, такие как противоальцгеймеровские, противовоспалительные анксиолитики и антидепрессивный эффект (8).Примечательно, что недавние исследования также показывают, что гармин обладает значительный противораковый эффект в нескольких раковых клетках, включая клетки гепатобластомы HepG2 (9), Клетки меланомы B16F-10 (10) и клетки рака желудка MGC-803 (11). Однако влияние гармина на распространение и миграцию раковых клеток яичников остается неизвестным. С этой целью настоящее исследование было направлено на исследовать противоопухолевый эффект и возможные механизмы пролиферация и миграция клеток, опосредованная гармином, в человеческом SKOV-3 клетки. Наши результаты показали, что гармин значительно подавляет пролиферацию и миграцию раковых клеток яичников через ингибирование пути ERK / CREB. Кроме того, сокращенный экспрессия фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), матрица металлопротеиназа (MMP) -2 и MMP-9 могут участвовать в Гармин-опосредованная пролиферация клеток SKOV-3. Материалы и методы Антитела и реагенты Антитела к фосфо-ERK1 / 2 (Thr202 / Tyr204) (кат. № 9101), ERK1 / 2 (кат.нет. 9102), фосфо-CREB (Ser133) (антитела к фосфо-ERK1 / 2 (Thr202 / Tyr204) (каталожный номер 9198), CREB (антитела к фосфо-ERK1 / 2 (Thr202 / Tyr204) (каталожный номер 9197), β-актин (антитела к фосфо-ERK1 / 2 (Thr202 / Tyr204) (кат. 4970), козья анти-кроличья пероксидаза хрена (HRP) -связанная антитела (антитела к фосфо-ERK1 / 2 (Thr202 / Tyr204) (кат. № 7074), а также U0126 (специфический ERK1 / 2 ингибитор) были приобретены у Cell Signaling Technology (Беверли, Массачусетс, США). Гармин, факторы роста эпидермиса (EGF), диметил сульфоксид (ДМСО) и 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенил бромид тетразолия (МТТ) был приобретен у Sigma-Aldrich (St. Луис, Миссури, США). Питательная среда и другие растворы, используемые для клеток культуры были приобретены в Invitrogen (Шанхай, Китай). SYBR® Premix Ex Taq ™ II был получен от Takara Bio, Inc. (Оцу, Япония). Культивирование и обработка клеток Клетки рака яичников человека SKOV-3 выращивали в Среда RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 50 мкг / мл стрептомицин, пенициллин 50 МЕ / мл. Культуры поддерживали при 37 ° C. в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2. Ячейки были регенерировались каждые 3 дня при достижении слияния 70–90%.Гармин растворяли в ДМСО и разбавляли до необходимого концентрации с питательной средой. Конечная концентрация ДМСО в питательной среде не превышала 0,1%. ПЦР с обратной транскрипцией Тотальную РНК экстрагировали с использованием реагента TRIzol. Обратная транскрипция выполнялась согласно инструкции производителя. инструкции от Invitrogen. ПЦР-анализ проводился с использованием следующие смысловые и антисмысловые праймеры: праймеры VEGF были вперед 5′-CTGGGCTGTTCTCGCTTCG-3 ‘и обратно 5’-CTCTCCTCTTCCTTCTCTTCTTCC-3 ‘. Праймеры MMP-2 были вперед 5′-CCGTCGCCCATCATCAAGTTC-3 ‘и обратно 5’-GCAGCCATAGAAGGTGTTCAGG-3 ‘. Праймеры MMP-9 были впереди 5’-TGGTCCTGGTGCTCCTGGTG-3 ‘и обратный 5′-GCTGCCTGTCGGTGAGATTGG-3’. Праймеры GAPDH были прямым 5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3 ‘ и обратный 5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3 ‘. Шаги усиления были следующим образом: 94 ° C в течение 5 минут, 30 циклов денатурации в течение 45 секунд при 95 ° C, отжиг 45 сек при 60 ° C, удлинение при 72 ° C в течение 45 сек, и удлинение при 72 ° C в течение 1 мин. После амплификации ПЦР продукты были подвергнуты электрофорезу на 1.5% агарозный гель и визуализированный окрашиванием бромистым этидием. Количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) КДНК получали, как описано выше. Использованные праймеры для ПЦР для анализа перечислены выше. Система ПЦР на 20 мкл была состоит из 2 мкл кДНК, 10 мкл SYBR Premix Ex Taq II, 0,4 мкл ROX Эталонный краситель II, 0,8 мкл 10 мкМ прямой праймер, 0,8 мкл 10 мкМ обратный праймер и 6 мкл ddh3O. Амплификация qRT-PCR была выполняется при следующих условиях: 1 цикл начального денатурация 30 сек при 95 ° C, 40 циклов денатурации 5 сек при 95 ° C с последующим синтезом ДНК в течение 30 сек при 60 ° C.После усиление, сбор и анализ данных в реальном времени выполнила. Вестерн-блоттинг После обработки различными соединениями клетки были собирают в указанное время, промывают и лизируют ледяным лизисом буфер. Лизаты клеток обрабатывали ультразвуком и центрифугировали при 12000 × г при 4 ° C в течение 5 мин. Концентрация белка в экстрактах составляла определяется с использованием реагента Брэдфорда от Bio-Rad Laboratories. Равные количества белка (20 мкг / дорожка) были разделены натрием. электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом (SDS-PAGE) и переносится на нитроцеллюлозные мембраны (Millipore, Bedford, MA, СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ).Затем мембрану блокировали в 5% обезжиренном сухом молоке в Трис-буферный раствор с Твин-20 в течение 2 ч при комнатной температуре и затем инкубировали с различными первичными антителами в течение ночи при 4 ° C. Использовали вторичные антитела, конъюгированные с HRP (1:20 000). затем в течение 2 ч при комнатной температуре. Иммунореактивные полосы были визуализируется усиленной хемилюминесценцией (Pierce, Rockford, IL, США) и количественно с помощью программного обеспечения ImageJ (Национальные институты of Health, Бетесда, Мэриленд, США). Анализ МТТ Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ-анализа.Вкратце, клетки высевали в 48-луночный планшет с плоским дном. (3 × 104 клеток на лунку) и культивировали в течение ночи. Затем клетки голодали в течение ночи и обрабатывали различными препаратами, как указано позже. Для эксперимента с курсом дозы клетки обрабатывали с концентрацией гармина и выдерживают 48 ч. На время конечно В эксперименте клетки инкубировали с 10 мкМ гармином в течение 12, 24 лет. 36 и 48 ч. После инкубации 20 мкл МТТ (5 мг / мл) добавляли к каждую лунку, и клеткам позволяли расти в полной среде при 37 ° C в течение 3 часов.Супернатант удаляли, затем добавляли 500 мкл ДМСО. добавляли в каждую лунку и покачивали в течение 10 мин для растворения кристаллов. Впоследствии определяли оптическую плотность с помощью микропланшета. считывающее устройство для спектрофотометра при 570 нм. Анализ заживления ран клеток SKOV-3 высевали в 6-луночный планшет и культивируется до сплошного монослоя. Клетки были предварительно обработаны гидроксимочевина (5 ммоль / л) для предотвращения пролиферации клеток. Наконечник пипетки (200 мкл) использовали для царапания раны по средней линии каждой лунки. и затем клетки дважды промывали PBS.После 0, 12, 24, 36 часов культивирования в RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки (контроль) или стимуляторы гармина, миграцию клеток оценивали с помощью измерение разницы в площади ран с помощью Leica Система анализа изображений DM2500 (Leica, Мангейм, Германия). Анализ образования колоний клеток SKOV-3 в фазе логарифмического роста были засевают в 6-луночный планшет и культивируют в среде RPMI-1640. с добавлением 10% FBS в течение ночи. Затем клетки обрабатывали с указанными концентрациями гармина еще две недели.Затем супернатанты отбрасывали, а клетки осторожно отделяли. трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). Впоследствии клетки фиксировали фиксатором, состоящим из метанол-ледяная уксусная кислота (3: 1) в течение 10 мин. Наконец, клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым в течение 20 мин. Изображения колоний были сняты цифровой камерой. Статистический анализ Данные указаны как среднее значение ± стандартная ошибка среднего не менее 3 самостоятельные эксперименты. Статистический анализ проводился с использованием t-критерий Стьюдента (сравнение двух групп) или односторонний анализ дисперсии (ANOVA) с последующим тестом Даннета или Тьюки (сравнение более двух групп).Значение p <0,05 было считается статистически разным. Все статистические анализы были проведено с использованием Prism версии 6.0 (программное обеспечение GraphPad). Результаты Гармин подавляет базальные клетки уровень пролиферации в клетках SKOV-3 Мы впервые исследовали влияние гармина на пролиферация клеток SKOV-3. Клетки SKOV-3 инкубировали с различной концентрацией гармина (0, 1, 2, 5, 10, 20 и 30 мкМ) в течение 48 ч, а затем измеряли жизнеспособность клеток с помощью анализа МТТ.В качестве показано на рис. 1А, гармин заметно ингибировал рост клеток SKOV-3 дозозависимым образом, так как концентрация менее 2 мкМ оказывала незначительное влияние, в то время как концентрации более 5 мкМ постепенно подавляли рост клеток SKOV-3 (рис. 1А). Мы следующие изучили влияние гармина в разное время лечения на Жизнеспособность клеток SKOV-3, клетки инкубировали с 10 мкМ гармина. на 12, 24, 36 или 48 часов. Анализы жизнеспособности клеток показали, что гармин значительно ингибировал рост клеток SKOV-3, за исключением 12-часовой инкубации, с наибольшим эффектом через 48 ч (рис.1Б). Для дальнейшего подтверждения ингибирующего действия клеток пролиферация гармина, анализы образования колоний. Как показано на рис. 1C, согласованные с помощью теста МТТ гармин значительно подавил колонию формирование клеток SKOV-3 дозозависимым образом (рис. 1C и D). Для предоставления дополнительных доказательства, мы затем обнаружили экспрессию пролиферирующих клеток ядерный антиген (PCNA), широко используемый белковый маркер для индикации пролиферации клеток. Мы обнаружили, что выражение PCNA был значительно снижен при лечении гармином в течение 24 дней. или 48 ч (рис.1E и F). Взятый вместе, наши вышеуказанные результаты убедительно показали, что гармин показал значительный ингибирующий эффект на рост клеток в SKOV-3 клетки. Гармин ингибирует EGF-индуцированный пролиферация клеток SKOV-3 Широко известно, что фактор роста эпидермиса рецептор (EGFR) часто сверхэкспрессируется при многочисленных раковых опухолях человека. включая рак яичников, и, как известно, активация EGFR участвует в росте и прогрессировании различных злокачественных новообразований (12,13). Затем мы спросили, является ли гармин способен подавлять индуцированную EGF пролиферацию клеток SKOV-3.К для этого клетки обрабатывали гармином в отсутствие или присутствие EGF (50 нг / мл) в течение 48 ч, а затем жизнеспособность клеток была измеряется анализом МТТ. Как показано на рис. 2A, EGF значительно увеличивал распространение SKOV-3 клеток, в то время как эта усиленная EGF пролиферация была заметно подавляется обработкой гармином (рис. 2А). В соответствии с предыдущими результатами, гармин не только ингибировал усиленную EGF пролиферацию, но также подавлял базальную уровень пролиферации клеток SKOV-3 в отсутствие EGF (Рис.2А). Подобные результаты были наблюдается с помощью анализа образования колоний. Как и ожидалось, гармин значительно подавляет способность к образованию колоний, индуцированную EGF (Рис. 2B и C). Эти результаты дополнительно подтвердил, что гармин, очевидно, может подавлять яичниковые пролиферация раковых клеток. Гармин значительно подавляет миграция клеток SKOV-3 Миграция клеток играет важную роль во время рака прогрессия. Чтобы изучить влияние гармина на миграцию Клетки SKOV-3, был проведен типичный анализ заживления царапин. для измерения коэффициента миграции.Как показали наши результаты выше, гармин был способен ингибировать пролиферацию клеток SKOV-3, это может помешать анализу результатов миграции клеток. Таким образом, чтобы исключить ингибирующее действие гармина на пролиферацию миграции, анализ заживления ран проводился в присутствии гидроксимочевины, которая предотвращает пролиферацию клеток, подавляя Синтез ДНК. Как показано на рис. 3, гармин значительно ингибировал миграцию клеток SKOV-3 на 24 °. и через 36 часов после обработки, в то время как через 12 часов эффект был незначительным (рис.3А и В). Harmine блокирует ERK1 / 2 и Фосфорилирование CREB в клетках SKOV-3 Мы продемонстрировали, что гармин значительно подавлял рост клеток SKOV-3. В связи с этим возник вопрос, как гармин действует, чтобы подавить рост клеток SKOV-3. Митоген-активированный белок пути киназы (MAPK) составляют большую модульную сеть, которая регулирует множество физиологических процессов, включая клеточные рост и дифференциация. Таким образом, мы сначала наблюдали Уровни фосфорилирования ERK1 / 2 после гармина лечение.Как показано на рис. 4, гармин вызывал быстрое снижение уровня фосфорилирования ERK1 / 2 без изменений суммы ERK1 / 2 уровни экспрессии (фиг. 4A). Точно так же уровень фосфорилирования CREB, важный фактор транскрипции, который играет важную роль в клетке распространение, также было уменьшено таким же образом, как и ЭРК1 / 2 (рис. 4Б), который можно предположить, что гармин ингибирует ERK1 / 2 фосфорилирование, которое, в свою очередь, подавляло активацию CREB. Гармин ингибирует EGF-индуцированный Фосфорилирование ERK1 / 2 и CREB в клетках SKOV-3 Гармин значительно угнетал клетку пролиферация и фосфорилирование ERK1 / 2 и CREB в Клетки SKOV-3, однако, мы не знаем, имеет ли ингибирующий эффект гармина на пролиферацию клеток опосредовано Путь ERK1 / 2 / CREB.Чтобы убедиться в этом, мы исследовали, может ли гармин блокировать EGF-индуцированный Фосфорилирование ERK1 / 2 и CREB. Как показано на рис. 5, мы сначала подтвердили, что EGF лечение значительно увеличило фосфорилирование ERK1 / 2 и CREB (рис. 5A и Б). Однако как EGF-индуцированные ERK1 / 2, так и CREB фосфорилирование заметно ингибировалось обработкой гармином (Рис. 5A и B). Показывать что фосфорилирование CREB происходило ниже ERK1 / 2, мы оценили действие селективного ингибитора EKR1 / 2 на EGF-индуцированное фосфорилирование CREB в клетках SKOV-3.Ячейки были предварительно обработали в течение 30 минут U0126 (10 мкМ), а затем стимулировали EGF. Мы обнаружили, что U0126 блокирует EGF-индуцированные ERK1 / 2 и CREB (рис. 5C и D) фосфорилирование, предполагая, что CREB действовал как нижестоящий фактор ERK1 / 2. Хармин снижает экспрессию VEGF, MMP-2 и MMP-9 в ячейках SKOV-3 Так как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и матриксные металлопротеиназы (ММП), особенно желатиназы Было показано, что ММП-2 и ММП-9 играют важную роль в пролиферация, миграция и метастазирование многих первичных эпителиальных опухоли (14,15), затем мы исследовали влияние гармин на экспрессию VEGF, MMP-2 и MMP-9 в СКОВ-3 клетки.Как показано на фиг. 6A, ПЦР-анализ с обратной транскрипцией показал, что ген транскрипция VEGF, MMP-2 и MMP-9 были значительно снижается в присутствии гармина (10 мкМ) на 48 h (рис. 6A и B). Последовательно, количественный анализ ПЦР в реальном времени также показал, что гармин заметно подавлял уровень мРНК VEGF (фиг. 6C), MMP-2 (фиг. 6D) и MMP-9 (фиг. 6E). Обсуждение В настоящем исследовании мы исследовали противоопухолевое влияние и потенциальный механизм гармина на рак яичников человека клетки.Наши результаты показали, что гармин не только значительно ингибирует пролиферацию и миграцию клеток SKOV-3, но также подавлял индуцированную EGF пролиферацию клеток SKOV-3. Более того, этот противоопухолевый эффект гармина может быть связан с ингибированием EKR1 / 2 / CREB и подавление экспрессии VEGF и MMP. Многие природные алкалоиды, такие как камптотецин, винкристин и эллиптицин обладают сильными противораковыми свойствами. агентов в последние годы (16). Эти алкалоиды убивают опухолевые клетки различными биохимическими способами действие, такое как ингибирование апоптоза, ингибирование топоизомеразы I и II и ингибирование образования микротрубочек. Однако молекулярные механизмы противоопухолевой активности β-карболины полностью не определены. Следует отметить, что сообщается, что некоторые β-карболины и родственные им соединения, по-видимому, имеют цитотоксическое действие на несколько линий клеток, включая раковые клетки и нейроны гранул мозжечка. Хотя цитотоксические агенты, которые вызывают гибель клеток и, в конечном итоге, уменьшение опухоли – обычное явление. противоопухолевые препараты и до сих пор наиболее широко используются во всем мире (17), нецитотоксический, препараты с молекулярной направленностью, которые подавляют рост опухоли без прямого цитотоксичность вызывает наибольшее беспокойство (18).В нашем исследовании тормозящий эффект роста клеток в присутствии гармина может быть результатом двух возможные причины из-за неспецифического цитотоксического действия гармина который убивает раковые клетки, или этот гармин может подавлять пролиферация клеток SKOV-3 без индукции острой клеточной повреждать. Чтобы отличить последнее от первого, мы измерили ячейку жизнеспособность клеток SKOV-3, обработанных 10 мкМ гармина или без него, для 12 ч. Наши результаты показали, что существенной разницы не было. между жизнеспособностью контрольных клеток и обработанных гармином клетки.С другой стороны, недавнее исследование показало, что лечение с гармином увеличивает пролиферацию культивируемых нейральных предшественников клетки без повреждения ДНК или гибели клеток (19). Кроме того, было обнаружено, что гармин способствовать пролиферации клеток в результате воздействия на куриные эмбрионы гармина заметно увеличенное включение BrdU и количество митотических клеток в спинном мозге (20). Вместе с нашими результатами, можно предположить, что ингибирование пролиферация клеток SKOV-3 гармином не может быть связана с его неспецифический цитотоксический эффект. Наши результаты показали, что гармин ингибирует базальную уровень пролиферации клеток SKOV-3. Примечательно, что это также значительно подавлял EGF-индуцированную пролиферацию клеток SKOV-3, предполагая идеальный противоопухолевый эффект гармина. Аберрантный экспрессия и передача сигналов EGFR-опосредованного пути являются связаны с различными видами рака человека, включая рак груди, толстой кишки, головы и рак шеи, поджелудочной железы, легких и яичников. Несомненно, EGFR и члены его семьи оказались наиболее полезными биомаркерами и рациональная мишень для лечения рака (21).Стоит отметить, что EGFR был сообщается, что сверхэкспрессия наблюдается в 60% случаев рака яичников (22), а увеличенное выражение и активация EGFR связана с высоким индексом пролиферации клеток, высокая скорость миграции и стромальной инвазии (23,24). Это может до некоторой степени объяснить, почему гармин подавляет базальную уровень пролиферации клеток SKOV-3. Однако как гармин влияет на Путь передачи сигналов EGFR требует дальнейшего изучения. Пути митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) такие как ERK1 / 2 играют важную роль в регулировании пролиферации и миграции раковых клеток.В соответствии с результаты показывают, что гармин ингибирует распространение SKOV-3 клеток, фосфорилирование ERK1 / 2 было глубоко блокируется лечением гармином. Кроме того, гармин также блокировал Фосфорилирование CREB, которое, как сообщалось, подавляет апоптоз, индуцируют пролиферацию, миграцию клеток и опосредуют метастазирование опухоли (25). Поскольку манера торможения фосфорилирования CREB было вполне в соответствии с ERK1 / 2, предполагая, что CREB действует ниже по течению ERK1 / 2. Эту гипотезу подтвердили следующие данные.Во-первых, мы заметили, что фосфорилирование ERK1 / 2 и CREB, опосредованные EGF, заметно подавлялись. в присутствии гармина. Во-вторых, индуцированный EGF CREB фосфорилирование может быть значительно заблокировано U0126, ингибитором широко используется для блокировки активности ERK1 / 2, что указывает на EGF-индуцированное фосфорилирование CREB опосредуется ERK1 / 2. Таким образом, мы заключаем, что ингибирование пути MEK / ERK, которое, в свою очередь, заблокированная активность CREB участвует в подавляющем эффекте гармина на EGF-индуцированную пролиферацию клеток при раке яичников человека клетки. Деградация внеклеточного матрикса (ЕСМ) и базальные мембраны опухолевыми клетками является критическим шагом в процессы инвазии и метастазирования опухоли (26). Матричные металлопротеиназы (ММП) представляют собой семейство протеолитических ферментов, регулирующих различные клеточные поведение, имеющее отношение к биологии рака, через деградацию внеклеточный матрикс, окружающий опухоли (14). В нашем исследовании мы обнаружили, что гармин может подавлять экспрессию MMP-2 и MMP-9. Рано адгезия и метастазирование раковых клеток яичников опосредуются Семейство белков ММП, экспрессия которых повышена во время прогрессирования рака яичников (27).Хотя считалось, что MMP быть тесно коррелированным с инвазией и метастазированием опухоли (27), исследования также показывают, что ингибирование действия MMP-2 и MMP-9 могут привести к снижение ремоделирования ВКМ и подавление эндотелиальных клеток распространение и миграция (28). Более того, в соответствии с нашими результатами, недавнее исследование указывает на то, что что активация пути ERK1 / 2 / CREB способствует экспрессия MMP-2 и MMP-9, которые могут объяснять пролиферация клеток рака легких (29). С другой стороны, наши результаты также показали, что гармин может подавлять экспрессию VEGF.Поскольку VEGF является наиболее важным митогенным фактором и фактором выживания участвует в ангиогенезе, в то время как ангиогенез является необходимым для рост солидных опухолей, сосудистое нацеливание было исследовано как потенциальная стратегия подавления роста опухоли и метастазирования. Таким образом, этот результат дополнительно подтвердил противоопухолевый эффект гармина. Однако, способен ли гармин ингибировать ангиогенез в развитие солидной опухоли требует дальнейшего изучения. Благодарности Настоящее исследование поддержано грантами Исследования традиционной китайской медицины (нет.2016B032), Наука и Проект технологического планирования (№ 20175032) провинции Цзянси Комиссия по здравоохранению и планированию семьи, Ведомство науки и Технологическая программа Наньчана (№ 2016-ZDXXM-039). Глоссарий Сокращения Сокращения: CREB циклический аденозинмонофосфат белок, связывающий элемент ответа ЕСМ внеклеточный матрикс EGF фактор роста эпидермиса EGFR рецептор фактора роста эпителия ERK 1/2 киназа, регулируемая внеклеточным сигналом 1/2 МАПК митоген-активированная протеинкиназа ММП матричная металлопротеиназа VEGF Фактор роста эндотелия сосудов Список литературы 1 Торре Л.А., Брей Ф., Сигель Р.Л., Ферли Дж., Lortet-Tieulent J и Jemal A: Глобальная статистика рака, 2012 г.CA Рак J Clin. 65: 87–108. 2015. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 2 Коулман Р.Л., Монк Б.Дж., Суд А.К. и Херцог TJ: Последние исследования и лечение поздней стадии эпителия. рак яичников. Нат Рев Клин Онкол. 10: 211–224. 2013. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 3 Мукерджи А.К., Басу С., Саркар Н. и Гош AC: Достижения в лечении рака с использованием натуральных продуктов на растительной основе.Curr Med Chem. 8: 1467–1486. 2001. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 4 McChesney JD: Натуральные продукты в лекарстве открытие – организация успеха. P R Health Sci J. 21: 91–95. 2002. PubMed / NCBI 5 Cragg GM, Newman DJ и Snader KM: Natural продукты в открытии и разработке лекарств. J Nat Prod. 60: 52–60. 1997. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 6 Цао Р, Пэн В., Ван З. и Сюй А: бета-карболиновые алкалоиды: биохимические и фармакологические функции.Curr Med Chem. 14: 479–500. 2007. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 7 Патель К., Гадевар М., Трипати Р., Прасад С.К. и Patel DK: обзор медицинской важности, фармакологического активность и биоаналитические аспекты бета-карболинового алкалоида «Хармин». Азиатский Пак Джей Троп Биомед. 2: 660–664. 2012. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 8 Фарзин Д. и Мансури Н.: Антидепрессантный эффект гармана и других бета-карболинов при тест принудительного плавания на мышах.Eur Neuropsychopharmacol. 16: 324–328. 2006. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 9 Цао М.Р., Ли Цюй, Лю З.Л., Лю Х.Х., Ван В., Ляо XL, Pan YL и Jiang JW: Гармин индуцирует апоптоз в клетках HepG2 через митохондриальный сигнальный путь. Гепатобилиарный панкреат дис Int. 10: 599–604. 2011. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 10 Хамса TP и Куттан G: Хармин активирует внутренние и внешние пути апоптоза меланомы B16F-10.Chin Med. 6: 112011. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 11 Чжан П., Хуан Ч.Р., Ван В., Чжан XK, Чен JJ, Wang JJ, Lin C и Jiang JW: гидрохлорид гармина запускает G2 остановка фазы и апоптоз в клетках MGC-803 и SMMC-7721 путем повышающая регуляция p21, активация каспазы-8 / Bid и понижающая регуляция ERK / Плохой путь. Phytother Res. 30: 31–40. 2016. Просмотреть статью: Google Scholar: PubMed / NCBI 12 Лафки Дж. М., Уилкен Дж. А., Барон А. Т. и Майл Нью-Джерси: Клинические последствия ErbB / эпидермального фактора роста (EGF) семейство рецепторов и его лиганды при раке яичников.Биохим Биофиз Acta. 1785: 232–265. 2008. PubMed / NCBI 13 Лю Л.З., Ху XW, Ся Ц., Хэ Дж, Чжоу Ц., Ши X, Фанг Дж. И Цзян Б.Х .: Активные формы кислорода регулируют эпидермальный фактор роста сосудистого эндотелия фактор роста и индуцируемая гипоксией экспрессия фактора-1альфа через активацию AKT и P70S6K1 в клетках рака яичников человека. Free Radic Biol Med. 41: 1521–1533. 2006. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 14 Newby AC: матричные металлопротеиназы регулируют миграцию, разрастание и гибель гладких сосудов мышечные клетки путем разрушения матрикса и нематричных субстратов.Cardiovasc Res. 69: 614–624. 2006. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 15 Бернатчес П.Н., Сокер С. и Сироис М.Г.: Влияние фактора роста эндотелия сосудов на эндотелиальные клетки пролиферация, миграция и синтез факторов активации тромбоцитов является Flk-1-зависимым. J Biol Chem. 274: 31047–31054. 1999. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 16 Demain AL и Vaishnav P: Натуральные продукты для химиотерапии рака.Microb Biotechnol. 4: 687–699. 2011 г. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 17 Kummar S, Gutierrez M, Doroshow JH и Murgo AJ: Разработка лекарств в онкологии: классические цитотоксики и молекулярно-направленные агенты. Br J Clin Pharmacol. 62: 15–26. 2006 г. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 18 Fox E, Curt GA и Balis FM: Клинические исследования дизайн исследования целевой терапии.Онколог. 7: 401–409. 2002 г. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 19 Дакич В, Масиэль Р.М., Драммонд Х., Насименто JM, Trindade P и Rehen SK: Хармин стимулирует распространение нейронные предшественники человека. PeerJ. 4: e27272016. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 20 Хеммерле Б., Улин Э., Гимера Дж., Беккер В., Guillemot F и Tejedor FJ: временная экспрессия Mnb / Dyrk1a пары выхода из клеточного цикла и дифференцировки предшественников нейронов путем индукции экспрессии p27KIP1 и подавления передачи сигналов NOTCH.Разработка. 138: 2543–2554. 2011. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 21 Сешачарюлу П., Поннусамы депутат, Харидас Д., Джайн М., Ганти А.К. и Батра С.К .: Нацеленность на сигнальный путь EGFR в терапии рака. Эксперт считает, что цели. 16: 15–31. 2012 г. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 22 Димова И, Захариева Б, Райчева С, Димитров Р., Доганов Н. и Тончева Д.: Анализ тканевых микрочипов Изменения количества копий EGFR и erbB2 в опухолях яичников.Int J Gynecol Рак. 16: 145–151. 2006. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 23 Dancey JE и Freidlin B: Targeting рецептор эпидермального фактора роста – мы не попали в цель? Ланцет. 362: 62–64. 2003. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 24 Лассус Х, Сихто Х, Леминен А, Йоэнсуу Х, Изола Дж., Нуппонен Н.Н. и Буцов Р. Амплификация генов, мутация, и экспрессия белка EGFR и мутации ERBB2 в серозных рак яичников.J Mol Med (Берл). 84: 671–681. 2006. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 25 Аггарвал С., Ким С.В., Рю С.Х., Чанг В.С. и Koo JS: Подавление роста клеток рака легких путем нацеливания на циклические Белок, связывающий элемент ответа AMP. Cancer Res. 68: 981–988. 2008 г. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 26 Лу П, Уивер В.М. и Верб З .: внеклеточный матрикс: динамическая ниша в прогрессировании рака.J Cell Биол. 196: 395–406. 2012. Просмотр статьи: Google Scholar: PubMed / NCBI 27 Egeblad M и Werb Z: Новые функции для матриксные металлопротеиназы в прогрессировании рака. No related posts. Published by alexxlab View all posts by alexxlab Добавить комментарий Отменить ответ Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены * Комментарий * Имя * Email * Сайт Сохранить моё имя, email и адрес сайта в этом браузере для последующих моих комментариев. Δ